ВИДОВОЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПО ПОЛИМОРФИЗМУ САТЕЛЛИТНОЙ ДНК

SPECIES GENOTYPING BY SATELLITE DNA POLYMORPHISM

Gulnara Jaxybayeva

мaster of technical sciences, senior lecturer, «Toraigyrov University», Kazakhstan, Pavlodar,

Nikolai Kochnev

Doctor of biological sciences, professor, Novosibirsk State Agrarian University, Russia, Novosibirsk

Аннотация. В статье приводятся принципы видового генотипирования по полиморфизму сателлитной ДНК. Полиморфизм ДНК используется для исследования генетической изменчивости и наследования полиморфных вариантов. Полиморфные последовательности ДНК используются для генотипирования особей, оценки генетического полиморфизма, гетерозиготность популяции, в селекции с помощью маркеров (MAS – marker assistant selection). Исследователей интересует изменчивость селекционируемых признаков овец различных линий казахской курдючной полугрубошерстной породы «Байыс».

Abstract. The article presents the principles of species genotyping by satellite DNA polymorphism. DNA polymorphism is used to study genetic variation and the inheritance of polymorphic variants. Polymorphic DNA sequences are used for genotyping individuals, assessing genetic polymorphism, population heterozygosity, and marker assistant selection (MAS). Researchers are interested in the variability of the selected traits of sheep of various lines of the Kazakh fat-tailed semi-coarse-wool breed of the «Baiys».

Ключевые слова: полиморфизм; полиморфизм длин рестриктных фрагментов; рестрикционные эндонуклеазы; генотипирование; сателлитная ДНК.

Keywords: polymorphism; restriction fragment length polymorphism; restriction endonucleases; genotyping; satellite DNA.

Введение

В целях реализации проекта «Молекулярно-генетические механизмы экспрессии генов, детерминирующих мясные качества овец Казахстана» актуально описать принципы видового генотипирования по полиморфизму сателлитной ДНК (Л. И. Калашникова, 1999). Полиморфизм ДНК используется для исследования генетической изменчивости и наследования полиморфных вариантов. Полиморфные последовательности ДНК используются для генотипирования особей, оценки генетического полиморфизма, гетерозиготность популяции, в селекции с помощью маркеров (MAS – marker assistant selection).

Исследователей интересует изменчивость селекционируемых признаков овец различных линий казахской курдючной полугрубошерстной породы «Байыс».

Расширение производства качественной баранины является одной из приоритетных задач развития отечественного мясного овцеводства. Решение данной проблемы становится возможным через разведение существующего поголовья овец исходя из генетических ресурсов.

Для решения проблем ускорения селекции и племенной работы в мясном овцеводстве необходимо формирование стад с желательным уровнем продуктивности, адаптированных к конкретным регионам разведения, промышленным технологиям, стойкостью животных к разным заболеваниям при сокращении времени селекционного процесса. Развитие молекулярной генетики, в частности, появление метода полимеразной цепной реакции, позволяющей амплифицировать большие количества определённых участков ДНК с последующим анализом полиморфизма, качественно изменило возможности генотипирования животных, поиска ключевых генов, полиморфизм которых вносит существенный вклад в реализацию хозяйственно-полезных признаков.

В связи с этим, идеей проекта является изучение генотипа опытных животных, фенотипические проявления признаков, характеризующиеся показателями роста и развития животных, мясной продуктивности и технологических свойств мяса баранины породы «Байыс».

Материалы и методы исследований.

Молекулярно-генетические маркеры позволяют получать информацию о полиморфизме генов и исследовать, какие варианты генов имеют преимущественное распространение у групп организмов, несущих желательный комплекс признаков в конкретных условиях среды. На основе такой информации можно направленно формировать генофонды с необходимыми генными сочетаниями. Перспективной системой генетического маркирования на уровне ДНК генома животных является ПДРФ (полиморфизм длин рестриктных фрагментов).

Разработанные методы ДНК-тестирования (ПЦР-ПДРФ) удобны для проведения массовых анализов сельскохозяйственных животных для решения задач селекции. ПДРФ наблюдается при гидролизе ДНК рестрикционными эндонуклеазами и электрофоретическом фракционировании. Варианты ПДРФ с большим выбором рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) рассматриваются как локус-специфические генетические маркеры.

Генотипирование по полиморфизму сателлитной ДНК является важной задачей в реализации программы по сохранению и использованию генетических ресурсов. Часто повторяющиеся последовательности ДНК обладают более высокой вариабельностью, чем структурные гены и используются для меж-и внутривидового генотипирования. Сопоставление сателлитных последовательностей является прямым и информационным подходом к оценке генетической вариабельности. После гидролиза ДНК рестриктазами и электрофоретического фракционирования выявляются фракции ДНК, обогащённые высокоповторяющимися последовательностями, в которых фрагменты ДНК ограничены с обеих сторон сайтами гидролиза для нуклеаз. Апробированные ферменты: AluI, BamHI, BspI201, BstNI, BsuRI, RsaI, EcoRI, HaeIII, HinfI, MspI, PstI.

Принцип ПДРФ в том, что рестриктазы имеют сайты узнавания в ДНК (специфические положения тетра- и гексануклеотидные последовательности) и гидролизуют фофософдиэфирные связи ДНК. При обработке рестриктазой образец ДНК образуется определённое количество фрагментов фиксированного размера, т.к. для взятого в анализ фермента количество сайтов и их локализация строго определены. После рестрикции фрагменты сохраняют отрицательный заряд, присущий ДНК. В геле под действием электрического поля фрагменты разделяются в зависимости от молекулярной массы, пропорциональной длине, выраженной в количестве пар нуклеотидов (пн).

Каждая рестриктаза даёт определённое количество фрагментов, располагающихся друг за другом, образуя шлейф на дорожке в геле после электрофореза. Дискретные фрагменты представляют собой высокоповторяющиеся последовательности ДНК.

Для каждой рестриктазы в одной и той же ДНК получается своя картина распределения фрагментов в геле по длине. Если в структуре ДНК произошли мутации (замена одного азотистого основания на другое), то исчезает или возникает сайт узнавания. Изменяется и картина распределения фрагментов, видимость полос на геле после рестрикции. Различая, которые наблюдаются по длине рестрикционных фрагментов в случаях исчезновения или возникновения сайтов узнавания в результате мутации, применения разных рестриктаз, описывается как полиморфизм длин рестриктных фрагментов (ПДРФ).

Метод ПДРФ для детекции специфически повторяющихся последовательностей ДНК успешно применяется для видового генотипирования двух видов одного подсемейства Caprinae – домашних овец и коз.

Ряд полос образует паттерны в области 50–10000 пн. Чёткая специфическая картина при электрофорезе фрагментов рестрикции ядерной ДНК овец возникает за счёт расщепления различных семейств повторяющихся последовательностей ДНК. При высокой копийности выявляется чёткая полоса семейства.

Сумма повторов ДНК, число мономеров, проявленных в виде полосы после гидролиза эндонуклеазой, рассматривается как отдельная фракция ДНК, картирование которой даст информацию о мутациях в этой части ДНК.

Выявленные на электрофорезе полосы могут быть мажорными ярко выраженными и минорными бледными. По специфике взаимодействия флуоресцирующего агента-красителя бромистого этидия с молекулой ДНК интенсивность свечения зависит от частоты встречаемости фрагмента и его длины.

Не все рестриктазы позволяют выявить дискретные полосы при электрофоретическом анализе рестриктов. Например, при использовании HindIII для рестрикции ядерной ДНК овец наблюдается сплошной шлейф гидролизованной ДНК – это множество фрагментов уникальных, мало повторяющихся последовательностей ДНК. В этом случае бромистый этидий не регистрирует короткие фрагменты. Для повышения информативности метода рестрикционного анализа частых повторов ДНК с целью выявления мелких фрагментов, исследователи используют радиоактивные метки или расширяют количество используемых рестриктаз.

При использовании радиоактивной метки расщепление одной рестриктазой позволяет выявить 10–20 фрагментов, а при окраске бромистым этидием максимальное число фракций 1–8. Меньшее количество полос не влияет на специфичность их распределения.

Метод прямого рестрикционного анализа сателлитной фракции ДНК даёт информацию о множестве локусов генома. Использование ряда рестриктаз для анализа ядерного генома позволяет получить картину распределения семейств повторяющихся последовательностей ДНК.

Учёными ВНИИплем (Московская область, Лесные Поляны) установлено, что при исследовании разных пород овец (романовская, советский меринос, польский меринос, финский ландрас, ровни-марш) из различных географических регионов установлено, что схемы рестрикции ДНК сходны между собой по числу и величине ярких полос (мажорных бэндов). Индивидуальные и половые различия не были обнаружены.

Исследования рестрикционного полиморфизма установило, что распределение сайтов рестрикции в сателлитах ядерной ДНК овец имеет высокую степень внутривидовой консервативности. Полученные паттерны являются специфическими для каждой использованной рестриктазы (AluI, BgIII, HindIII, MspI, PvuI). В силу видовой консервативности полученные паттерны являются, по сути, «дактилоскопическим отпечатком» исследованной группы животных.

Паттерны овец и коз отличаются, но имеются общие черты. В наборах рестриктов AluI, BgIII, HindIII, MspI, PvuI различных пород домашних овец не было выявлено ни одной общей полосы с паттерами коз. Фрагменты рестрикции частых повторов ДНК овец и коз с эндонуклеазами BamHI, EcoRI полностью совпали. Картины рестрикционного расщепления ферментами EcoRI, HaeIII, StyI, HinfI, PstI имели одинаковы полосы по некоторым длинам фрагментов, характерные для подсемейства Caprinae, остальные полосы различались по длине и интенсивности свечения.

Полиморфизм повторяющихся фракций генома животных может быть выявлен без использования молекулярный гибридизации и радиоактивных меток. ПДРФ рекомендуется для определения видовой принадлежности, генетической паспортизации, анализа межвидовых гибридов.

Анализ ядерной ДНК методом ПДРФ заключается в том, что для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции. Они приводятся в описании, прилагаемом фирмой-изготовителем (СибЭнзим). Основные переменные параметры – температура инкубации 37 °С и состав буфера.

Результаты собственных исследований

Планируется после выделения ДНК сорбентным методом из цельной крови овец (ДНК-сорб-В, AmplySens), провести гидролиз ферментом PstI. Для гидролиза используется 2–5 ед. акт. фермента на 1 мкг ДНК. Реакция проводится в 20 мкл буфера, приготовленного согласно прописи фирмы-изготовителя рестриктазы или коммерческого буфера той же фирмы (СибЭнзим).

Длина рестриктных фрагментов ДНК определяется горизонтальным электрофорезом в 1–2 %-ном агарозном геле в буфере ТВЕ, в качестве маркера длин используют рестрикты ДНК pBR322/AluI, фага лямбда (EcoRI, HindIII, PstI, MvaI, MspI) или коммерческие наборы маркерных рестриктов DNA 1 kb Ladder (СибЭнзим).

Аликвоты из реакционных проб смешивают с буфером нанесения, содержащем 0,5 % бромфенолового синего в соотношении 5:1 по объёму, наносят в лунки геля и проводят электрофорез в ТБЕ буфере (18 мМ ТрисHCl, pH 8,5; 18мМ борной кислоты, 0,4 мМ ЭДТА) в течение 2–5 часов в зависимости от величины фрагментов ДНК.

Фрагменты ДНК визуализируют в проходящем УФ-свете на трансиллюминаторе по флуоресценции бромистого этидия, который вносят в гель при приготовлении в концентрации 0,05 %.

Заключение.

В целях реализации проекта «Молекулярно-генетические механизмы экспрессии генов, детерминирующих мясные качества овец Казахстана» будут использованы принципы видового генотипирования по полиморфизму сателлитной ДНК по опыту Всероссийского научно-исследовательского института племенного дела.