ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПРЕПАРАТЫ — АНТАГОНИСТЫ Н1-ГИСТАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ

1. Введение.

Изучение влияния препаратов-антагонистов Н1-гистаминовых рецепторов на показатели хемилюминесценции периферической крови здоровых доноров, эффектов дозозависимости и прайминга, позволяет определить нормальные показатели и динамику хемилюминесценции. Это необходимо для диагностики индивидуальной чувствительности к препарату, в том числе — возможности развития анафилактического шока. Существующие на данный момент способы диагностики индивидуальной непереносимости лекарственных препаратов in vivo длительны по времени, плохо воспроизводимы и представляют определённый риск сенсибилизации и развития анафилаксии. В связи с этим большой интерес представляет разработка методов диагностики in vitro. Имеются данные о возможности использования в этих целях люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ). Данная методика открывает большие перспективы для изучения индивидуальной реакции организма на лекарственные препараты, подбора оптимальной терапевтической дозы. Её значимость повышается благодаря безопасности, так как проводится in vitro.

В последнее время внимание аллергологов привлечено к изучению терапевтических возможностей применения препаратов-антагонистов Н1-гистаминовых рецепторов, в частности - препарата «Хлоропирамин», при аллергических реакциях замедленного типа. Однако для повышения эффективности и безопасности лечения необходимо иметь метод быстрого подбора терапевтических доз и определения индивидуальной чувствительности к препаратам. Для подобного использования ХЛ необходимо изучить влияние «Хлорпирамина» на её динамику и особенности, в том числе — у практически здоровых доноров.

2. Материалы и методы.
   1. Материалы.

Материалом для исследования послужила кровь 18 пациентов находящихся под наблюдением в лаборатории клинической иммунологии ФГУ НИИ ФХМ ФМБА РФ по поводу вторичных иммунодефицитных состояний, не страдающих аллергическими заболеваниями. Среди них 8 мужчин, 10 женщин, средний возраст пациентов — 47 лет. Иммунодефицитное состояние в девяти случаях вызвано вирусом Эпштейна-Барр, в пяти случаях — вирусом герпеса 6 типа, и бактериальной инфекцией в четырех случаях. Нужно отметить что пол, возраст и основное заболевание не влияют на результаты данного исследования и в дальнейшем не обсуждаются.

1. Методы.

В данной работе был использован метод люминолзависимой хемилюминесценции, выполнялась процедура инкубации образцов с препаратами.

1. Инкубация с препаратами.

Сначала приготавливается рабочий раствор исследуемого препарата, образец лейковзвеси делился на чётное количество частей, конкретные числа проб в каждом отдельном различается, обоснование выбора числа проб и их назначения указаны отдельно при описании методики каждого из экспериментов. Затем проводилось центрифугирование образца крови при частоте 1500 об/мин в течение 10 мин. После этого, при помощи автоматической пипетки («Ленпипет», РФ) собиралась лейковзвесь. Затем 160 мкл лейковзвеси и 40 мкл рабочего раствора смешивались в отдельном эппендорфе и инкубируется 20 минут при температуре 37 °С.

1. Метод люминолзависимой хемилюминесценции.

В осуществлении многих химических реакций в биологических системах участвуют радикалы кислорода и азота (ионы кислорода, оксид азота, высоко реактивные свободные радикалы, гидроксильный радикал кислорода, синглетный кислород и т. д.). Эти реакции получили название свободно-радикальных. К ним относятся реакции перекисного окисления липидов, реакции «кислородного взрыва», осуществляющие основные процессы противоинфекционного иммунитета [10]. Радикалы — весьма активные в химическом отношении частицы. Их взаимодействие сопровождается выделением значительной энергии, достаточной для образования продуктов в электронно-возбужденном состоянии и появления «сверхслабого свечения», называемого хемилюминесценцией. Наблюдаемое при свободно-радикальных реакциях в биологических системах свечение получило название «собственной» или «спонтанной» ХЛ. Так как выраженность «собственного» свечения достаточно низкая, его изучение и использование в научных и диагностических целях затруднено. Однако в присутствии активаторов ХЛ, например люминола, появление радикалов сопровождается интенсивным свечением, регистрация которого широко используется в медико-биологических и клинических исследованиях [6]. Также этому способствует создание чувствительной аппаратуры для оценки уровня свободно-радикальных процессов в клетках, тканях и органах животных и человека.

Механизм реакций люминола, приводящих к образованию возбужденных молекул продукта, включает в себя две стадии: окисление люминола, затем восстановление окисленного продукта супероксидным радикалом, либо любым другим сильным окислителем. Восстановление люминола приводит к образованию электронно-возбужденного продукта (Р*) и высвечиванию фотона [5].

Для измерения спонтанной ХЛ смешивались 20 мкл лейковзвеси с 2 мл рабочего раствора люминола. Для приготовления рабочего раствора люминола сначала было необходимо приготовить исходный раствор — 10 мг люминола (производитель «Sigma-Aldrich», РФ) на 40 мл раствора Хенкса (производитель «ПанЭко», РФ). Затем для приготовления рабочего раствора смешивалось 1 мл исходного раствора с 9 мл раствора Хенкса. Для измерения активированной ХЛ в пробирке (производитель «Гем», РФ) смешивалась убитая культуры Staphylococcus aureus (производитель «БЛ», РФ) с лейковзвесью в концентрации 1:2 и затем инкубировалось в шейкере (производитель LV-1084, Латвия) в течение 10 минут при температуре 37 °С. Для регистрации данных ХЛ использовался люминометр Lum-5773 (ООО «ДИСофт», РФ) с программным обеспечением PowerGraphProfessional, в котором записывалось изменение интенсивности ХЛ (Вольты) во времени (минуты). Регистрация данных проводилась в течение 10 минут для каждой пробы.

При интерпретации полученных данных использовались следующие обозначения:

Io — интенсивность спонтанной ХЛ;

I — интенсивность активированной ХЛ;

n — индекс влияния применяемого метода на спонтанную ХЛ;

k — индекс влияния применяемого метода на активированную ХЛ;

m — индекс активации ХЛ.

Для вычисления индексов n и k бралось отношение значения интенсивности после применения метода к исходному значению интенсивности, для получения индекса m — отношения показателей активированной и спонтанной ХЛ.

3. Статистическая обработка данных.

Определение статистической достоверности полученных результатов выполнено с использованием t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2010.

4. Полученные результаты и их обсуждение.

Материалом для исследования послужили образцы крови 14 пациентов наблюдающихся в лаборатории клинической иммунологии ФГУ НИИ ФХМ ФМБА РФ. Для каждого пациента были определены показатели спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, рассчитаны индексы влияния «Хлоропирамина» либо гистамина на спонтанную ХЛ, индуцированную ХЛ, и индексы активации n, k, и m. Выявлены статистически значимые различия вышеперечисленных индексов от контрольных значений с использованием t-критерия Стьюдента. Для спонтанной ХЛ, активированной ХЛ и индекса m статистической гипотезой является равенство средних контрольных значений и средних значений при определённой дозе препарата. Для индексов n и k статистической гипотезой является равенство средних значений минимальной дозе и средних значений при другой известной дозе препарата.

1. Влияние неспецифических факторов среды

Методика

Приготавливался рабочий раствор препарата «Хлоропирамин» (производитель НТФФ ПОЛИСАН, РФ) из расчёта 5.0, 7.5 и 10.0 мкл препарата на 1 мл крови. Затем из пробы крови была выделена лейковзвесь. Образец лейковзвеси одновременно делился на 16 частей. Определялись показатели спонтанной и активированной ХЛ после инкубации с препаратом в течении 20 мин. Было проведено 4 серии опытов подряд, при этом время начала каждой следующей серии отличалось от времени начала предыдущей на 80 мин.

Для определения спонтанной ХЛ 40 мкл рабочего раствора в отдельном эппендорфе смешивалось с 160 мкл лейковзвеси и инкубировались 20 минут при температуре 37 °С. При определении активированной ХЛ после 10 мин. инкубации в эппендорф добавлялись 100 мкл суспензии стафилококка, затем инкубация продолжалась 10 мин. при температуре 37 °С. Показатели ХЛ представлены в таблице 4.1.1, значения указаны в В*с.

Таблица 4.1.1

Показатели спонтанной и индуцированной ХЛ.

*(p<0,05)

Из данных представленных в таблице можно сделать вывод о статистически значимых различиях показателей спонтанной ХЛ при прайминге длительностью 160 мин, т. е. неспецифических воздействиях, которым подвергались пробы до инкубации с препаратом.

Таблица 4.1.2

Влияния прайминга на индекс активации n.

*(p<0,05)

Из данных представленных в таблице можно сделать вывод о статистически значимых различиях индекса активации при прайминге длительностью 160 мин.

1. Дозозависимый эффект.

Таблица 4.2.1

Показатели индекса активации m при различных дозах препарата.

*(p<0,05)

Таблица 4.2.2

Индекс влияния препарата на активированную ХЛ при различных дозах.

*(p<0,05)

При концентрации препарата 7,5 мкл/мл наблюдается статистически значимое индекса активации m. При концентрациях препарата 7,5 мкл/мл и 10,0 мкл/мл — уменьшение индекса влияния «Хлоропирамина» на активированную ХЛ k.

5. Выводы.

Таким образом, на основании полученных в ходе исследования данных, можно сделать следующие выводы:

1. Препарат-антагонист Н1-рецепторов «Хлоропирамин» оказывает влияние на уровень спонтанной и активированной хемилюминесценции, выявляемое в тесте in vitro. Эти изменения носят дозозависимый и индивидуальный характер. При интерпретации результатов ХЛ-тестов для подбора лечебных дозировок и определения индивидуальной чувствительности необходимо опираться на интегральные показатели [коэффициент активации m, коэффициенты влияния препарата на спонтанную (n) и активированную ХЛ (k)], а не на абсолютные.
2. Оптимальное время инкубации с препаратом, необходимое для получения информативных данных, равно 20 минутам. Влияние неспецифических факторов (контакт с чужеродной поверхностью, деплазмирование и т. п.) на показатели ХЛ начинает проявляться к 160 минуте от забора крови.

Список литературы:

1. Бакулев А.Н., Брусиловский Л.Я., Тимаков В.Д., Шабанов А.Н.// Большая медицинская Энциклопедия М., 1959.С. 216—218.
2. Владимиров Ю.А. //Эфферентная медицина. М., 1994. С. 51—66.
3. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., Измайлов Д.Ю. и др. // Биофизика 2006. Т. 71. С. 1215—1224.
4. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., Измайлов Д.Ю. // Хемилюминесценция как метод обнаружения и исследования свободных радикалов в биологических системах. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. С. 13—20.
5. Герасимов А.М., Гусев В.А., Брусков О.С.// Влияние экзогенной супероксиддисмутазы и 1,4 — диазобицикло-(2,2,2) — октана на устойчивость мышей к острой кислородной интоксикации. — Бюлл. экспер. биол. мед. — 1977. — Том 83. — № 2. — С. 147—150.
6. Герасимов А.М., Корнева Е.Н., Амелина Д.Ш.// Моделирование взаимосвязи перекись — генерирующих и НАДФН — зависимых процессов. В сб.: Окислительные ферменты животной клетки и регуляция их активности. Тез. Всер. симп. Горький. — 1978. — С. 23—24.
7. Осипов А.Н., Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А. //Биохимия. 2004. Т.  69. С. 103—113.
8. Ярилин А.А. // Основы иммунологии 1999 г. С. 59.
9. Ярилин А.А. // Основы иммунологии 1999 г. С. 66—69.
10. Ярилин А.А., // Основы Иммунологии 2009 г. С. 121—175.
11. Ярилин А.А. // Основы иммунологии 1999 г. С. 247—263
12. Allen R.C. //Methods Enzymol. 1986. Vol. 133. P. 449—493.
13. Vladimirov Y.A. // Free radicals in the environment, medicine and toxicology. L., 1994. P. 345—373.
14. Vladimirov Y.A., Sherstnev M.P. // Soviet medical reviws. Sect. B. Physicochemical aspect of medicine. L., 1991. Vol. 2, Pt. 5. P. 1—43.