ДИАГНОСТИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ MODIOLUS MODIOLUS ИЗ ФОНОВЫХ И ИМПАКТНОЙ АКВАТОРИЙ ЯПОНСКОГО МОРЯ

Активное развитие аквакультуры и биомониторинговых исследований двустворчатых моллюсков привело к необходимости поиска и разработки простых и эффективных методов оценки их физиологического состояния.

Центральной системой у моллюсков, отвечающей за формирование физиологических адаптаций к изменениям, происходящих в окружающей среде, поддержание гомеостаза и обеспечение иммунной защиты, является транспортно-защитная разновидность тканей внутренней среды — гемолимфа. Поэтому показатели активности клеточных факторов иммунитета моллюсков могут являться объективными диагностическими критериями их физиологического состояния. При этом фагоцитоз, как фундаментальная составляющая защитной функции организма, может служить одним из основных параметров оценки иммунного статуса.

Исследования клеточного иммунитета проводили на половозрелых особях M. modiolus, собранных в мае-июне 2006 г. из б. Троицы, зал. Восток и б. Киевка (условно фоновые акватории), в июне 2009 г. из зал. Восток и гав. Спортивной (импактная акватория), в июне 2010 и 2011 гг. из зал. Восток. Для оценки активности гемоцитов моллюсков определяли два показателя фагоцитоза: фагоцитарную активность (ФА) — долю фагоцитирующих гемоцитов, выраженную в процентах, и фагоцитарный индекс (ФИ) — среднее количество поглощенных бактерий на одну фагоцитирующую клетку. Для этой цели клеточные суспензии гемолимфы инкубировали с заранее термически убитыми и мечеными флуоресцентным красителем FITC бактериями рода Staphilococcus. Препараты реакций in vitro фагоцитоза анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axioimager.

Флуоресцентный анализ реакций in vitro фагоциоза показал, что фагоцитарной активностью обладают не все типы гемоцитов M. modiolus, при этом фагоциты различаются числом поглощенных бактерий (рис. 1).

Рисунок 1. Типичный вид гемоцитов M. modiolus в реакции in vitro фагоцитоза с бактериями S. aureus, инактивированными нагреванием и меченными ФИТЦ. Тушение флуоресценции неинтернализованных бактерий обеспечено инкубацией препаратов в 0.1 % изотоничном растворе трипанового синего. А — фазовый контраст, Б — флуоресценция. Масштабный отрезок — 20 мкм

Количественная оценка реакции in vitro фагоцитоза позволила установить пределы вариативности фагоцитарного статуса гемоцитов у моллюсков M. modiolus из условно фоновых акваторий Российской части Японского моря: зал. Восток, б. Киевка и б. Троицы.

Рисунок 2. Сравнительный анализ фагоцитарного статуса гемоцитов M. modiolus в выборках из условно фоновых акваторий. Гистограмма показывает средние значения ± доверительные интервалы. Примечания: * — достоверность различий средних независимых выборок (p<0,05); ** — достоверность различий средних независимых выборок (p<0,001)

На рис. 2 представлены результаты сравнительного анализа трех выборок из условно фоновых акваторий по показателям фагоцитоза гемоцитов M. modiolus. Установили, что для животных, выловленных из б. Киевка, средняя ФА составила 48.2 ± 1.8 %, средний ФИ — 4.5 ± 0.15. Значения ФА варьировали от 36 до 68%, ФИ находился в пределах от 2.6 до 5.8. Гемоциты модиолусов, выловленных из акватории зал. Восток, проявляли среднюю ФА, равную 57.0 ± 2.0% , а средний ФИ состовлял 4.4 ± 0.19. Значения ФА варьировали от 32 до 75 %, а ФИ изменялся в пределах от 2.7 до 5.9. Следует отметить, что животные, выловленные из зал. Восток и б. Киевка в подавляющем большинстве имели средние значения параметров фагоцитоза, тогда как доля модиолусов из б. Троицы с ФИ ниже 4.0 и значением ФА менее 50 % была преобладающей и составляла 75 % от всей выборки. В среднем у животных из б. Троицы ФА достигала 49.3 ± 3.0 %, ФИ — 3.1 ± 0.03. При этом диапазон вариации значений показателей фагоцитоза увеличился: ФА изменялась от 27 до 82 %, ФИ — от 1.8 до 5.0.

Несмотря на вышеуказанный факт, средние значения ФА по трем выборкам достоверно не различались, в то время как средний ФИ для особей из б. Троицы был достоверно ниже такового для б. Киевка и зал. Восток (рис. 2). Среднее значение ФА гемоцитов для всей совокупности животных из условно фоновых акваторий составило 52.0 ± 1.8 %, ФИ − 4.1 ± 0.13.

Завершающим этапом работы стал сравнительный анализ фагоцитарного статуса гемоцитов M. modiolus из импактной и условно фоновой акваторий, на основе выборок, полученных в 2009 г., который показал, что у 77 % особей из гав. Спортивной ФА ниже 40 %, тогда как у животных из зал. Восток эти показатели значительно выше: лишь 10 % животных имеют значения ФА ниже 40 %. При этом ФА у животных из гав. Спортивной варьировала от 24 до 53 %, ФИ — от 1.6 до 2.6. Максимальное количество гемоцитов моллюсков из зал. Восток, участвующих в фагоцитозе, достигало 65 %, минимальное — 21 %, а ФИ варьировал от 2,6 до 6,4.

Рисунок 5. Сравнительный анализ фагоцитарного статуса гемоцитов M. modiolus в выборках из условно фоновой (зал. Восток) и импактной (гав. Спортивная) акваторий. Гистограмма показывает средние значения ± доверительные интервалы. Примечания: * — достоверность различий средних независимых выборок (p<0,05); ** — достоверность различий средних независимых выборок (p<0,001)

Результаты сравнения выборок из условно фоновой и импактной акваторий по средним показателям ФА и ФИ представлены на рис. 5. Средние значения показателей фагоцитоза у животных референсной группы, выловленных в 2009 г. из зал. Восток, составили: ФА — 51.0 ± 2.0 %, ФИ — 4.1 ± 0.17. Модиолусы из гав. Спортивной имели существенно более низкие средние значения, как ФА (36.0 ± 2.0 %), так и ФИ (2.1 ± 0.05). Следует отметить, что средние обоих показателей фагоцитоза у животных из гав. Спортивной характеризовались достоверно более низкими значениями по сравнению с таковыми, полученными для всех остальных выборок, исследованных в данной работе.

Исходя из полученных результатов, в качестве показателя, объективно дифференцирующего физиологическое состояние моллюсков M. modiolus из условно фоновых и импактных акваторий, можно рекомендовать фагоцитарную активность гемоцитов, которая является достаточно стабильным параметром при нормальных условиях среды и достоверно снижается в условиях длительного стресса.