ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИДРОКСИПРОЛИНА В СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА И ЕГО КОРРЕКЦИИ

В эксперименте изучена динамика изменений фракций гидроксипролина в сыворотке крови у крыс-самцов Вистар массой 230—250 г в зависимости от продолжительности интраперитонеального введения Тромбовазима при экспериментальном инфаркте миокарда (ИМ). Выявлено, что существует четкая зависимость между степенью отклонения от нормы уровней содержания фракций гидроксипролина в сыворотке крови и наличием изменения метаболизма соединительной ткани органа. Количественное и качественное определение гидроксипролина может быть использовано в диагностике для определения степени изменения метаболизма соединительной ткани. Введением Тромбовазима достигается снижение негативных последствий ИМ за счет снижения деструкции и повышения репарации соединительной ткани.

Введение.

Инфаркт миокарда является одним из наиболее частых проявлений ИБС и одной из наиболее частых причин смерти в развитых странах. По данным В.А. Люсова (2001), распространенность инфаркта миокарда составляет около 500 на 100 000 мужчин и 100 на 100 000 женщин [4, с. 270].

Инфаркт миокарда — это ишемический некроз сердечной мышцы [7, с. 286]. В своем течение инфаркт миокарда проходит две стадии — некротическую и стадию рубцевания [7, с. 288], то есть стадию непосредственного поражения вследствие нарушения кровотока и стадию замещения пораженных тканей соединительной тканью. Таким образом, не возникает сомнений в актуальности определения активности метаболизма соединительной ткани и ее компонентов как показателей субституции миокарда.

Одним из основных видов волокон соединительной ткани являются коллагеновые волокна, которые состоят преимущественно из коллагена — фибриллярного белка, являющегося главным компонентом экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани. Особенностью строения данного белка является то, что 1/3 всех аминокислотных остатков составляет глицин, 1/3 — пролин и гидроксипролин, около 1 % — гидроксилизин [1, с. 662].

Важнейшим показателем метаболизма коллагена является содержание гидроксипролина. При нарушениях синтеза коллагена уменьшаются поперечные связи в фибриллах коллагена, что приводит к возрастанию содержания легкорастворимого коллагена. Поэтому у больных с нарушенным метаболизмом соединительной ткани увеличивается содержание в сыворотке крови его свободной фракции и уменьшается содержание связанной фракции. Таким образом, можно считать свободную фракцию гидроксипролина маркером деструкции, белковую — маркером репарации, а пептидносвязанную — маркером активности метаболизма коллагена в целом.

Исходя из выше сказанного, можно выдвинуть гипотезу о том, что при помощи определения гидроксипролина можно оценить процессы репарации в миокарде.

В целях ускорения регенерации тканей необходимо создание условий усиленной трофики, что зачастую достигается при помощи различных лекарственных препаратов. Один из таких препаратов — Тромбовазим.

Тромбовазим — препарат, полученный методом электронно-лучевой иммобилизации молекулы субтилизина молекулой полиэтиленгликоля в Сибирском центре фармакологии и биотехнологии. Тромбовазим лизирует субстраты денатурированного белка в полостях и тканях, очищает сосудистое русло от продуктов повреждения тканей, уменьшает концентрацию фибрина в кровотоке, снижает степень тромбинемии и нормализует показатели внутрисосудистого микротромбообразования. Это приводит к восстановлению микроциркуляции и восстановлению функционирования тканей.

Цель.

Обосновать метод количественного определения фракций гидроксипролина в сыворотке крови, как маркера метаболизма соединительной ткани, при экспериментальном инфаркте миокарда и при введении Тромбовазима. Изучить влияние Тромбовазима на метаболизм соединительной ткани посредством исследования содержания фракций гидроксипролина в сыворотке крови при экспериментальном инфаркте миокарда.

Материалы и методы исследования.

Для эксперимента были использованы 30 крыс-самцов Wistar массой 230—250 г в возрасте 4 месяцев.

Наркоз проводился интраперитонеальным введением смеси золетила и ксилозина. Далее проводилась операция окклюзии коронарной артерии путем наложения на нее лигатуры. Для создания оперативного доступа на уровне 3—6 ребер. Отступя влево от грудины на 1 см производилось рассечение кожи, мышц и 4-ого, 5-ого и 6-ого ребер. Затем на левую нисходящую коронарную артерию накладывали лигатуру на расстоянии около 3 мм ниже левого предсердия. Время нахождения в открытой грудной клетке составляло не более 3 мин. Затем рану зашивали с последующей обработкой антибиотиком (ампициллином).

Прооперированные животные были разделены на группы: группа № 1 — контрольная, группа № 2 — опытная. Группе № 2 через 15 мин после операции вводили внутрибрюшинно раствор Тромбовазима (180 ЕД/кг в 2 мл физиологического раствора). Затем в течение месяца инъекции Тромбовазима осуществлялись два раза в сутки (в утренние и вечерние часы). Группе № 1 в соответствующие интервалы времени проводили внутрибрюшинное введение физиологический раствор в объеме 2 мл.

Далее все животные были перераспределены по следующим группам: группа № 1 — интактные крысы, группа № 2 — ИМ + введение физ. р-ра 7 дней, группа № 3 — ИМ + лечение Тромбовазимом 7 дней, группа № 4 — ИМ + введение физ. р-ра 1 мес., группа № 5 — ИМ + лечение Тромбовазимом 1 мес.

Затем под наркозом производился забор крови в целях определения фракций гидроксипролина (свободной, пептидно- и белковосвязанной) по методу Кузнецовой Т.П. (принцип метода основан на определении оптической плотности красного хромогена, полученного в результате конденсации продуктов окисления гидроксипролина с пара-диметиламинобензальдегидом). Кровь центрифугировалась. В центрифужную пробирку добавляли 1 мл сыворотки, 0,5 мл 5 %-й трихлоруксусной кислоты и 0,5 мл 5 %-й хлорной кислоты. Затем проводили центрифугирование при 3000 об\мин 6 минут. Надосадочную жидкость распределяли по 0,75 мл в две пробирки для определения свободной (пробирка № 1) и пептидносвязанной (пробирка № 2) фракций. Осадок использовался для определения белковосвязанной фракции (пробирка № 3).

Содержимое пробирки № 1 нейтрализовали 24 % раствором NaOH в присутствие индикаторного раствора (до появления устойчивой слабопурпурной окраски).

Содержимое пробирки № 2 гидролизовали в водяной бане 40 минут при температуре 60^оС. Затем также нейтрализовали 24 % раствором NaOH в присутствие индикаторного раствора (до появления устойчивой слабопурпурной окраски).

К содержимому пробирки № 3 добавляли 0,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 5 %-й трихлоруксусной кислоты и 0,5 мл 57 %-й хлорной кислоты, гидролизовали в водяной бане 6 часов при температуре 60^оС. Далее добавляли 0,25 г активированного угля и центрифугировали при 3000 об\мин 6 минут. Прозрачную часть гидролизата нейтрализовали 24 % раствором NaOH в присутствие индикаторного раствора (до появления устойчивой слабопурпурной окраски).

Далее во все пробирки добавляли 0,5 мл раствора хлорамина Б, 0,5 мл 57 %-й хлорной кислоты и 0,5 мл пара — диметилбензальдегида. Смесь помещали в водяную баню на 20 мин при 60^оС. Затем измеряли оптическую плотность содержимого пробирок № 1-3 при 557 нм. Расчет концентрации фракций гидроксипролина производился по калибровочной кривой. Полученные данные обрабатывали с использованием статистической программы “SPSS for Windows 17.0”, с вычислением медианы (Мe) и интерквартильного размаха (Q₁; Q₃). Различия между группами сравнения определяли по Манну-Уитни (р < 0,05).

Результаты исследования. Смертность животных составила 24 %. Признаки ишемии сердца наблюдалось визуально вскоре после перевязки артерии и выражались в побледнении зоны ишемии в первые 30—40 секунд, с последующим цианозом; в ослаблении сокращений в зоне ишемии и некоторой дилатации Наблюдаемое развитие ишемии совпадает с описанным в литературе (Асташов В.В., 1993).

Таблица 1.

Содержание фракций ГП в сыворотке крови при экспериментальном инфаркте миокарда при лечении тромбовазином

Как видно из таблицы в семидневном эксперементе наиболее выражены изменения в свободной фракции гидроксипролина (биохимического маркера деструкции белка коллагена), в группе № 2 показатель увеличился в 1,5 раза (p < 0,05), а в группе № 3 в 5 раз (p < 0,05). Помимо этого, отмечается понижение белковосвязанного гидроксипролина (биохимического маркера репарации коллагена) в группе № 2 на 79 % (p < 0,05) и в группе № 3 на 75 % (p < 0,05). Изменения данных показателей свидетельствуют о активации катаболизма и депресси анаболизма соединительной ткани.

В группах № 4 (ИМ + введение физ. р-ра 1 мес.) и № 5 (ИМ + лечение тромбовазимом 1 мес.) в сравнение с интактной так же наблюдается резкое увеличение титра свободного гидроксипролина и снижение белковосвязанного.

При оценке динамических показателей были отмечены следующие изменения: в группах № 2 и 4 (группы с применением физ. р-ра) выявлено увеличение свободного гидроксипролина в 1,5 (p < 0,05) и в 4 (p < 0,05) раза соответственно, в то время как в группах № 3 и 4 (с применением Тромбовазима) в 5 (p < 0,05) и 0,6 (p < 0,05) раза. Это указывает на то, что в группах без лечения отмечается тенденция к прогрессии катаболизма коллагена, а в группах с применением Тромбовазима, наоборот, происходит затухание деструкции коллагена. Так же особого внимания заслуживают изменения в белковосвязанной фракции: не смотря на то, что относительно интактной группы показатели других групп снижены (группа № 2 — на 79 % (p < 0,05), № 3 — на 75 % (p < 0,05) № 4 — на 21 % (p < 0,05), № 5 — на 22 % (p < 0,05)), наблюдается постепенное нарастание титра, что свидетельствует об активации синтеза коллагена и интенсивной регенерации соединительной ткани.

Из представленных выше данных следует вывод о влияние Тромбовазима — резкое снижение деструкции (снижение свободного гидроксипролина почти в 4 раза (p < 0,05) в группе № 5 сравнительно с группой № 3) при активной репарации (увеличение белковосвязанного гидроксипролина почти в 3 раза (p < 0,05) в группе № 5 сравнительно с группой № 3). Влияние на метаболизм противоречиво: не смотря на низкую скорость восстановления нормального метаболизма (в группе № 3 на 1,5 % (p < 0,05) в сравнение с интактной, а в группе № 5 на 1,75 %) при лечении Тромбовазимом, показатель почти в 2 (p < 0,05) раза выше по сравнению с группами с применением физ. раствора (p < 0,05). Это указывает на более высокий уровень восстановления метаболизма при лечении Тромбовазимом.

Выводы:

1. Отмечена четкая зависимость между степенью отклонения от нормы уровней содержания фракций гидроксипролина в сыворотке крови и наличием изменения метаболизма соединительной ткани;
2. Количественное и качественное определение гидроксипролина может быть использовано в диагностике для определения уровня метаболизма соединительной ткани;
3. Тромбовазим способствует стабилизации метаболизма соединительной ткани, что проявляется снижением негативных последствий инфаркта миокарда.

Список литературы:

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. — М.: Медицина, 1998. — 704 с.
2. Дайхин Е.И., Козлова Н.И., Сиванова Л.А. Некоторые актуальные проблемы биохимической диагностики патологии соединительной ткани // Педиатрия. — 1983. — № 4. — С. 68—70.
3. Кадурина Т.И. Наследственные коллагенопатии. Клиника, диагностика, лечение, диспансеризация. — СПб.: Невский диалект, 2000. — 270 с.
4. Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов: Т. 6 Диагностика болезней сердца и сосудов: — М.: Мед. лит., 2003. — 464 с.
5. Серов В.В., Шехтер А.В. Соединительная ткань — М.: Медицина, 1981. — 312 с.
6. Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. — М.: Медицина, 1969. — 375 с.
7. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия — М.: Медицина, 1995 — 688 с.
8. Шараев П.Н. Метод определения свободного и связанного оксипролина в сыворотке крови // Лаб. дело. — 1981. — № 5. — С. 283—285.