ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ И ЛАБОРАТОРНЫЕ ПЕРСПЕКТИВЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩЕЙ ОПУХОЛЕВОЙ ДНК ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Рак молочной железы — злокачественная опухоль железистой ткани молочной железы, по частоте встречаемости в популяции — третья нозологическая форма среди злокачественных опухолей после рака легкого и рака желудка. По данным ВОЗ Рак молочной железы занимает первое место среди онкологических заболеваний женщин, составляя порядка 16 % всех случаев рака. Рак груди встречается во всех возрастных группах. По статистике, каждая 8-я женщина имеет риск получить диагноз РМЖ. Результаты исследований Минздрава РФ — неутешительны. В России диагноз «рак молочной железы» ежегодно ставят 54 000, что составляет около 19 % от всех женских онкологических заболеваний и с каждым годом процент распространения заболевания продолжает увеличиваться.

Повсеместный рост заболеваемости и смертности от рака молочной железы ставит эту проблему в ряд наиболее важных, требующих пристального внимания широкого круга специалистов. Прогресс в изучении биологических прогностических факторов, использование их для выработки оптимального плана лечебных мероприятий, совершенствование диагностических методов, включая современную маммографию, КТ, УЗИ и МРТ, и морфологических методик с широким привлечением иммуногистохимических исследований (цитологические исследования, использование онкомаркеров, исследование циркулирующей опухолевой ДНК) позволяют максимально индивидуализировать лечебные программы.

Одним из наиболее перспективных методов изучения специфики рака молочной железы является терапевтическое и лабораторное исследование циркулирующей опухолевой ДНК.

цоДНК представляют собой небольшие фрагменты мутировавших молекул ДНК, которые высвобождаются в кровоток из опухолевых клеток. Они несут в себе мутации, которые являются отличительными признаками рака, что доказывает их принадлежность к первичной опухоли.

В зависимости от степени заболевания опухолевая ДНК может составлять от менее 1 до 50 % свободноплавающей ДНК, которая присутствует в плазме крови. Ее количество можно оценить по мутациям, ассоциированным со злокачественными новообразованиями, в частности, по двум генам, TP53 и PIK3CA. По мнению Карлоса Кальдаса, который руководил исследованием цоДНК у женщин с прогрессирующим раком молочной железы, «в каждом типе рака молочной железы можно обнаружить, по меньшей мере, одну мутацию для мониторинга».

Свободно циркулирующие фрагменты опухолевой ДНК потенциально позволяют получить гораздо более полную информацию о генетических характеристиках опухоли молочной железы. Они могут быть измерены как количественно (для определения истинного объема опухолевой массы, ее динамики в процессе лечения), так и оценены качественно — в идеальной ситуации являясь «отпечатками пальцев» всей опухоли, а не ее отдельного фрагмента. Несмотря на то, что «представительство» ДНК из различных очагов может быть неодинаковым, данная методика представляется весьма перспективным инструментом для изучения опухолей.

В целом, пациенты со злокачественными опухолями имеют более высокое содержание циркулирующей ДНК, чем здоровые люди, что обусловлено дополнительным поступлением в кровоток фрагментов ДНК, выделяющихся из опухолевых клеток [12—14]. Количество цоДНК зависит от опухолевой массы в организме пациента — с увеличением объема опухоли одновременно нарастает и количество опухолевых клеток, подвергшихся апоптозу и некрозу, что в свою очередь увеличивает количество цоДНК. Кроме объема опухолевой массы, количество выделяемой в кровоток цоДНК может зависеть от гистологического типа опухоли, размера опухолевых очагов и их васкуляризации. Увеличению количества цоДНК способствуют и особенности утилизации погибших опухолевых клеток: если при физиологической гибели нормальных клеток организма продукты их распада поглощаются и перерабатываются фагоцитами, то в опухолевой ткани процесс фагоцитоза менее эффективен, в связи с чем происходит накопление клеточного детрита, выделяющего опухолевую ДНК в циркуляцию [15]. Доля опухолевой ДНК в общем количестве циркулирующей ДНК может составлять от 0,01 до 90 % [16].

Преимущества и недостатки метода выделения цоДНК по сравнению с каждым из существующих методов диагностики и контроля злокачественных новообразований в процессе лечения

1. По сравнению с биопсией.

Для того чтобы следить за ходом лечения пациентов с диагнозом рака молочной железы и предпринимать следующее направление курса лечения, нужно делать множество биопсий. Согласно результатам исследований, анализ циркулирующей опухолевой ДНК позволяет надеяться на преодоление ключевых недостатков, характерных для рутинной биопсии. Одним из ключевых преимуществ анализа цоДНК является возможность более комплексного изучения опухоли при сохранении высокого уровня специфичности, практически не уступающего рутинной биопсии.

Подход к изучению опухолей с использованием материала, полученного при рутинной биопсии, страдает значимыми «врожденными» недостатками, основным из которых является то, что случайным образом выбранный фрагмент опухоли (первичной или метастаза) может не отражать всего многообразия, обусловленного внутриопухолевой гетерогенностью. Но даже в случае, если удается получить репрезентативный образец опухолевой ткани, клон опухоли, отвечающий за резистентность к выбранной терапии, может быть крайне мал на момент начала лечения.

Кроме того, у людей с раком на поздних стадиях часто несколько опухолей, которые нужно исследовать, и даже разные части одной опухоли могут в разной степени развивать резистентность к лекарству. Биопсия травматична и рискованна как в молочных железах, таких и в других труднодоступных и хрупких органах.

2. По сравнению с белковыми биомаркерами.

Циркулирующая ДНК может справляться лучше с поставленной целью, чем белковые биомаркеры, которые так активно исследуются и совершенствуются учеными в течение десятилетий. Белки используются в больницах для диагностики болезней и для того, чтобы следить за процессом лечения пациентов. Например, простат-специфический антиген является биомаркером рака простаты, но этот анализ может быть ложноположительным ввиду других причин, по которым этот антиген может содержаться в крови. Анализ на цоДНК реже ложноположителен, т. к. он содержит мутации и другие геномные изменения, которые являются показателями раковых клеток. И хотя большинство белковых биомаркеров живет в крови на протяжении нескольких недель, период полураспада цоДНК меньше, чем 2 часа. Поэтому такой способ дает намного более точную картину настоящей опухоли, чем использование белков в качестве биомаркера, опоздание которых может достигать нескольких недель.

3. По сравнению с исследованием циркулирующих опухолевых клеток.

цоДНК являются более чувствительными, чем циркулирующие опухолевые клетки – неповрежденные опухолевые клетки, которые плавают в токе крови (что также является областью интенсивных исследований). При проведении одного из исследований специалистами было установлено, что в образцах крови присутствуют как циркулирующие опухолевые клетки, так и цоДНК, причем цоДНК превосходят опухолевые клетки в отношении 50: 1. При этом цоДНК присутствовало во всех образцах, где были обнаружены свободные опухолевые клетки, а опухолевых клеток не обнаружили.

Недостатки метода.

Несмотря на эту перспективу, цоДНК не готов играть основную роль в клиниках. Во-первых, самый чувствительный аппарат для их нахождения BEAMing опирается на уже известные мутации, которые ему нужно искать. Эта информация может быть определена:

• пробами биопсии;
• секвенированием мутаций проб;
• моделированием определенных молекулярных структур пациента, которые нацелены на исправление этих мутации.

Затем эти структуры используются для анализа проб крови. Именно такой лабораторный подход должен быть повторен для каждого пациента. Альтернатива этому, в секвенирование всех экзонов. Такой метод не требует никаких знаний про рак заранее, но секвенировать и анализировать каждый образец очень тщательно для выявления редких мутантных фрагментов неприлично дорого.

Нужно также отметить то, что технологии определения цоДНК не являются действенными, когда речь идет о раке на ранних стадиях. В исследовании метод помогает определять все случаи рака на стадии 2 и выше, но не опухоли на 1 стадии. И это вполне логично, ведь опухолям на поздних стадиях намного легче выбрасывать в кровь большие количества ДНК. Поэтому возможности использования цоДНК ограничиваются чувствительностью приборов для скрининга рака.

Перспективы использования метода.

цоДНК возможно использовать для того, чтобы обнаружить резистентные мутации с нуля. В последние годы исследователи описали то, как они полностью секвенировали экзоны — 1 % генома, который кодирует белок — в образцах крови 6 человек, которые лечились от поздних форм рака груди, легких и яичек. В пяти случаях, бесцельный поиск открыл пути развития резистентности, например мутации, которые предотвращают связывание лекарственных средств с белками-мишенями.

Ранее обнаружение резистентности позволит врачам перестать вводить пациентам токсичные и дорогостоящие лекарства, которые уже вряд ли действуют. И путем определения мутации, которая объясняет возникновения резистентности, врачи могут найти эффективные альтернативы или комбинации лекарств.

Таким образом, на настоящий момент в цоДНК могут быть оценены практически любые изменения генетического материала, которые ранее могли быть исследованы лишь при изучении материала, полученного при рутинной биопсии опухоли. Однако в отличие от обычной биопсии исследование цоДНК позволяет оценить весь спектр генетических аберраций, имеющихся в опухоли (вне зависимости от внутриопухолевой гетерогенности), так как в кровоток попадают фрагменты из всех опухолевых очагов, находящихся в организме [29; 33]. В связи с этим анализ цоДНК может рассматриваться как «тотальная» жидкая биопсия опухоли.

Список литературы:

1. Campbell L.L., Polyak K. Breast tumor heterogeneity: cancer stem cells or clonal evolution? Cell Cycle 2007; 6 (19): 2332—8.
2. Delgado P.O., Alves B.C., Gehrke F.S. et al. Characterization of cell-free circulating DNA in plasma in patients with prostate cancer. Tumor Biol 2013; 34 (2): 983—6.
3. Desai J., Shankar S., Heinrich M.C. et al. Clonal evolution of resistance to imatinib in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumors. Clin Cancer Res 2007; 13 (18 Pt 1): 5398—405.
4. Diehl F., Schmidt K., Choti M.A. et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med 2007; 14 (9): 985—90.
5. Gerlinger M., Rowan A.J., Horswell S. et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012; 366 (10):883—92.
6. Greaves M., Maley C.C. Clonal evolution in cancer. Nature 2012; 481 (7381).
7. Hashad D., Sorour A., Ghazal A., Talaat I. Free circulating tumor DNA as a diagnostic marker for breast cancer. J Clin Lab Anal.
8. Heidary et al. Breast Cancer Research 2014 The dynamic range of circulating tumor DNA in metastatic breast cancer.
9. Jahr S., Hentze H., Englisch S. et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res 2001; 61 (4): 1659—65.
10. Lo Y.M.D., Hjelm N.M., Fidler C. et al. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. N Engl J Med 1998; 339 (24):1734—8.
11. Mandel P., Metais P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l'homme. C R Seances Soc Biol Fil 1948; 142 (3–4): 241—3.
12. Papageorgiou E.A., Karagrigoriou A., Tsaliki E. et al. Fetal-specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21. Nat Med 2011; 17 (4): 510–3. 7. Raetz E.A., Borowitz M.J., Devidas M. et al. Reinduction platform for children with first marrow relapse of acute lymphoblastic leukemia: A Children's Oncology Group Study. J Clin Oncol 2008; 26 (24): 3971—8.
13. Schwarzenbach H., M ller V., MildeLangosch K. et al. Evaluation of cell-free tumor DNA and RNA in patients with breast cancer and benign breast disease. Mol BioSystems 2011; 7 (10): 2848—54. 2012; 26 (6): 467—72.
14. Stroun M., Lyautey J., Lederrey C. et al. About the possible origin and mechanism of circulating DNA: Apoptosis and active DNA release. Clin Chim Acta 2001; 313 (1–2): 139—42.
15. Taniguchi K., Okami J., Kodama K. et al. Intratumor heterogeneity of epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer and its correlation to the response to gefitinib. Cancer sci 2008; 99 (5): 929—35.
16. Wardelmann E., Merkelbach-Bruse S., Pauls K. et al. Polyclonal evolution of multiple secondary KIT mutations in gastrointestinal stromal tumors under treatment with imatinib mesylate. Clinical Cancer Res 2006; 12 (6): 1743—9.