Статья:

ОТ ГЕНА АРОА — К ТРАНСГЕННЫМ РАСТЕНИЯМ КАРТОФЕЛЯ

Конференция: XXVI Студенческая международная заочная научно-практическая конференция «Молодежный научный форум: естественные и медицинские науки»

Секция: 2. Биологические науки

Выходные данные
Пасалари Х.М. ОТ ГЕНА АРОА — К ТРАНСГЕННЫМ РАСТЕНИЯМ КАРТОФЕЛЯ // Молодежный научный форум: Естественные и медицинские науки: электр. сб. ст. по мат. XXVI междунар. студ. науч.-практ. конф. № 7(25). URL: https://nauchforum.ru/archive/MNF_nature/7(25).pdf (дата обращения: 29.11.2022)
Лауреаты определены. Конференция завершена
Эта статья набрала 2 голоса
Мне нравится
Дипломы
лауреатов
Сертификаты
участников
Дипломы
лауреатов
Сертификаты
участников
на печатьскачать .pdfподелиться

ОТ ГЕНА АРОА — К ТРАНСГЕННЫМ РАСТЕНИЯМ КАРТОФЕЛЯ

Пасалари Хоссейн Мохаммад
студент белорусского государственного университета, Республика Беларусь, г. Минск
Евтушенков Анатолий Николаевич
научный руководитель, проф. белорусского государственного университета, Республика Беларусь, г. Минск

 

Картофель является наиболее широко распространенной овощной культурой в республике Беларусь. Были исследованы выращивания картофеля, устойчивых к гербициду глифосату с использованием метода агробактериальной трансформации для переноса гена ароА. Были использованы методом ПЦР и ПЦР-реального времени (RT-PCR) для подтверждения экспрессии гена aroA в трансформантах и определения относительного количества экспрессии фитопатогенных генов картофеля при выращивании трансформантов на различные концентрации глифосата.

Введение.

Трансгенные растения широко используются в фундаментальных исследованиях по биологии, особенно в молекулярной биологии и молекулярной генетике [5, c. 83]. При создании трансгенных растений встречается ряд трудностей, которые ограничивают генетическую модификацию многих видов растений. Получение стабильно трансформированных растений включает несколько этапов: выбор генов, которые будут вводиться в геном и подготовка вектора для их переноса в геном растения, введение вектора в растительные клетки методом, отбор трансформантов, а также подтверждение наличия и экспрессии [2, c. 496]. Создание растений, устойчивых к широко используемому во всем мире гербициду глифосату (N-фосфонометил-глицин), позволит существенно повысить эффективность сельскохозяйственного производства, значительно увеличить урожайность культур. В настоящее время гербицид глифосат широко используется во всем мире. Это обусловлено его высокой эффективностью, дешевизной и низкой токсичностью. Кроме того, несмотря на многолетнее широкое использование глифосата в растениеводстве, природная устойчивость к нему встречается достаточно редко. Глифосат ингибирует 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазу (EPSPS) растений. EPSPS — фермент шикиматного пути, локализованного в хлоропластах, в результате которого происходит биосинтез ароматических аминокислот [1, c. 480; 6, c. 370]. Цель данной работы состояла в доказательстве трансгенности для экспрессии гена ароА во всех трансформантах картофеля выросших на канамицине с ПЦР и также сравнение относительного клоичества экспрессии генов, устойчивых к фитопатогенам картофеля во всех растениях картофеля выросщих на различные концентрации глифосата,с ПЦР- реального времени (RT-PCR).

Методы исследования.

Трансформацию проводили векторами, сконструированными на кафедре молекулярной биологии БГУ, несущим селективный ген nptII устойчивости к антибиотику канамицину и целевой ген аroА Dickeya dadantii с одной мутацией, который кодирует измененную енол пирувил шикимат фосфат синтазу, что определяет устойчивость к гербициду глифосату. Для проведения экспериментов по агробактериальной трансформации картофеля, использовали штаммы Agrobacteriumtumefaciens AGL0 и LBA4404. Трансформацию агробактерий проводили методом замораживания-оттаивания [10, c. 184]. Клетки бактерий культивировали на стандартной агаризованной среде LB при температуре 28ºС. В среду добавляли антибиотики тиментин (150 мг/л) для избирательного роста агробактерий и канамицин (25 мг/л) как селективный маркер. Отбор клонов проводился методом ПЦР. Полученные агробактериальные штаммы с необходимыми плазмидами использовались для трансформации растений картофеля.

Трансформация растений картофеля.

Для трансформации картофеля были выбраны сорта Одиссей, Скарб и Ветразь. Для переноса плазмид в агробактерии была проведена прямая трансформация агробактерии методом замороживания-оттаивания [10, c. 184]. Трансформация стеблевых эксплантов картофеля проводилась на проростках 4-недельного возраста (только первые 6 междоузлий, начиная от верхушки). Агробактерии выращиваются в течение 12—15 часов в термостате (28ºС) на среде УЕВ без антибиотиков (ночная культура), экспланты инкубировали в 30 мл жидкой УЕВ, содержащей 1:10 ночной культуры агробактерий в течение 15 мин, затем подсушивают на стерильном фильтре (не пересушивать) и помещали на чашки Петри со средой CIM1(соли MS, витамины по Морелю, сахароза 20 г/л, БАП (6-бензиламинопурин), 1 мг/л, 0,1 мг/л НУК (нафтилуксусная кислота), агар 7 г/л рН 5,8). После 2 дней сокультивации (чашки с эксплантами накрыть листом бумаги) экспланты помещали на среду СIM1, содержащую 150 мг/л тиментина и 25 мг/л канамицина. После 7 дней культивации экспланты переносили на среду SIM1(соли MS, витамины по Морелю, сахароза 20 г/л, 1 мг/л БАП (6-бензиламинопурин), 0,1 мг/л гибберелиновая кислота, агар 7 г/л рН 5,8) с добавлением антибиотика тиментина в концентрации 150 мг/л и селективного агента (канамицина в концентрации 50 мг/л). В дальнейшем экспланты переносили на свежую среду SIM1 каждые 2 недели до появления побегов [3, c. 1590; 4, c. 1195; 7, c. 3].

Для повышения эффективности каллусогенеза использовали контрастную стимуляцию: помещали чашки с эксплантами в темноту на 2 суток при температуре 24—25°С, переносили на неделю на свет (5000 Лк) на 25°С с фотопериодом 16/8 часов, далее экспланты переносили на свежую среду SIM1 каждые 2 недели до появления побегов.растения, для образования корней, высаживали на среду MS с добавлением 150 мг/л тиментина, 0,1 мг/л НУК и антибиотика канамицина. После 1—2 пассажей переносили на автоклавированную почву, были выделены ДНК и тотальной РНК для проведения ПЦР, методом [8, c. 432; 9, c. 5].

Подготовка раствора глифосата.

При подготовлении нужных растворов глифосата (N- (фосфонометил)-глицин), 40 мкл жидкого глифосата довести до обьема 4000 мкл дистилированной водой в соотношении 1:100 и затем пресаживали растения на различные концентрации глифосата (0, 1/500, 1/250, 1/100) мкл на 50 мл агаризованной среде MS.

Результаты и обсуждение.

Молекулярный анализ полученных растений.

Наличие гена aroA в геноме растений анализировали с помощью реакций амплификации с праймерами5′-GCCGAATCCCTGACGTTACAACC-3′ и 5′-CCGGCTGCCTGGCTAATCCGCGC-3′, с которыми синтезируется фрагмент размером 750 п.н. Реакционная смесь включала 1 мкл геномной ДНК каждого образца, по 2 мкМ каждого из праймеров, 2 мМ смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 5 единиц/мклTaq полимеразы в однократном реакционном буфере. Общий объем смеси составлял 20 мкл. Программа амплификации: денатурация 94°С 4 мин; 30 циклов: 94°С 30 с; 55°С 1 мин; 72°С, 1 мин 30 с; заключительный цикл: 7 мин при 72°С. Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в 1 %-ом агарозном геле в трис-ацетатной буферной системе.

кПЦР проводили на амплификаторе ДТ-96 (ДНК-Технология) с модулем детекции продуктов в режиме реального времени. Для определения уровней экспрессии генов растений картофеля использовали прямой и обратный праймеры (Таблица 1), Taq буфер «AM» и Taq полимеразу (2.5 ед.) реакционная смесь объемом 100 мкл содержала каждый праймер в концентрации 0.2 мкл, дНТф — по 0.1 мМ, а также интекалирующий краситель SYBRGreen 1 (Sigma) и референсный краситель ROX (праймтех) в рекомендованных производителем концентрациях. Продукты реакции детектировались в ходе 42 цикла чередующихся темпратур 94°С (2 мин) и 60°С (1 мин). Расчеты уровня экспрессии генов проводили по следующей схеме. Определяли разницу значений (∆ Ct), вычитая из конститутивно экспрессирующегося гена EF-1 α пороговое значение (Ct) PR-генов.

 

изобр

Рисунок 1. А — Трансформированные растения картофеля, выросшие на канамицине; В — Элктрофореграмма ПЦР продуктов с праймерами к гену aroA, полученных с ДНК и кДНК выделенной из трансформированного картофеля. Дорожки 1 и 2 (положительный контроль, отрицательный контроль и плазмидная ДНК PZH485), 3 — 7 — образцы ДНК, 8, 9,10 — образцы кДНК, — М — маркерная ДНК (1 kbDNAladderMix, Fermentas)

 

Рисунок 2. сравнение относительной экспрессии генов между концентраций 0 (контроль) и 1/500

 

Рисунок 3. сравнение относительной экспрессии генов между концентраций 0 (контроль) и 1/250

 

Рисунок 4. сравнение относительной экспрессии генов между концентраций 0 (контроль) и 1/100

 

Одной из целей генной инженерии является получение растений с ценными признаками для сельскохозяйственного производства. Нами была проведена агробактериальная трансформация трех сортов картофеля двумя генетическими конструкциями с геном aroA. Полученные трансформанты культивировали до формирования стеблей и корневой системы на среде Мурасига скуга с канамицином и тиментином. Тиментин добавляли для подавления роста агробактерий. Сформированные растения переносили сначала в стерильную почву в закрытом сосуде для предохранения от пересыхания, а через неделю культивировали в открытом сосуде при естественном освещении. aroA кодирует фермент, EPSPS. Глифосат ингибирует 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазу (EPSPS) растений. EPSPS — фермент шикиматного пути, локализованного в хлоропластах, в результате которого происходит биосинтез ароматических аминокислот. Для выделения ДНК отбирали листья с середины побегов. ПЦР анализ образцов ДНК выявил во всех растениях фрагмент aroA гена размером 750 нуклеотидов. Полученные трансгенные растения после размножения будут анализироваться на устойчивость к глифосату. Глифосат один из наиболее дешевых и безопасных гербицидов. Глифосат также подавляет развитие фитофторы, поэтому кажется перпективным использование глифосата для обработки картофеля от фитофтороза и сорняков.

 

Список литературы:
1.    Маниатис Т. Молекулярное клонирование / T. Маниатис, Э. Фрич, ДЖ. Сэмбрук // — M: мир. — 1984. — С. 480.
2.    Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия / С.Н. Щелкунов. — Новосибирск: Сибир. Универс. издание. — 2004. — 496 с.
3.    Beaujean A. Agrobacterium-mediated transformation of three economically important potato cultivars using sliced intermodal explants: an efficient protocol of transformation / A. Beaujean, R.S. Sangwan, A. Lecardonnel, BS-Norrel Sangwan // J. Exp. Bot. — Vol. 49. — № 326. — 1998. — P. 1589—1595.
4.    Broglie K. Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani / K. Broglie, I. Chet Holliday, M. Cressman, R. Biddle, P. Knowlton, S. Mauvais, C.J. Broglie // Science. — № 254. — 1991. — P. 1194—1197.
5.    Chang M.M. Agrobacterium-mediated transformation of a pea β-1,3-glucanase and chitinase genes in potato (Solanum tuberosum L.cv. Russet Burbank) using a single selectable marker / M.M Chang, D. Culley, J.J. Choi, L.A. Hadwiger // PlantSci. — № 163. — 2002. — P. 83—89.
6.    Comai L. An altered aroA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate / L. Comai, Sen L.C., Stalker D.M., // science. — 1983. — Vol. 221. — P. 370—371.
7.    Conner A.J, Williams M.K, Gardner R.C, Deroles S.C, Shaw M.L and Lancaster J.E. Agrobacterium-mediated transformation of New Zealand potato cultivars / A.J. Conner, M.K. Williams, R.C. Gardner, S.C. Deroles, M.L. Shaw, J.E. Lancaster // New Zealand J. Crop and Hort. Sci. — № 19. — 1991. — P. 1—8.
8.    Kingston R.E. Current Protocols in Molecular Biology. In: Preparation and Analysis of RNA. Published online January 2010 in Wiley Interscience, 2010. — 431—433.
9.    Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from plant tissues // plant molecular biology manual. 1988. — A6, 1—10.
10.    Transfection and transformation of A. tumefaciens / M. Holsters [et al.] // M GG. — 1978. — Vol. 163. — P. 181—187.