ОТ ГЕНА АРОА — К ТРАНСГЕННЫМ РАСТЕНИЯМ КАРТОФЕЛЯ

Картофель является наиболее широко распространенной овощной культурой в республике Беларусь. Были исследованы выращивания картофеля, устойчивых к гербициду глифосату с использованием метода агробактериальной трансформации для переноса гена ароА. Были использованы методом ПЦР и ПЦР-реального времени (RT-PCR) для подтверждения экспрессии гена aroA в трансформантах и определения относительного количества экспрессии фитопатогенных генов картофеля при выращивании трансформантов на различные концентрации глифосата.

Введение.

Трансгенные растения широко используются в фундаментальных исследованиях по биологии, особенно в молекулярной биологии и молекулярной генетике [5, c. 83]. При создании трансгенных растений встречается ряд трудностей, которые ограничивают генетическую модификацию многих видов растений. Получение стабильно трансформированных растений включает несколько этапов: выбор генов, которые будут вводиться в геном и подготовка вектора для их переноса в геном растения, введение вектора в растительные клетки методом, отбор трансформантов, а также подтверждение наличия и экспрессии [2, c. 496]. Создание растений, устойчивых к широко используемому во всем мире гербициду глифосату (N-фосфонометил-глицин), позволит существенно повысить эффективность сельскохозяйственного производства, значительно увеличить урожайность культур. В настоящее время гербицид глифосат широко используется во всем мире. Это обусловлено его высокой эффективностью, дешевизной и низкой токсичностью. Кроме того, несмотря на многолетнее широкое использование глифосата в растениеводстве, природная устойчивость к нему встречается достаточно редко. Глифосат ингибирует 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазу (EPSPS) растений. EPSPS — фермент шикиматного пути, локализованного в хлоропластах, в результате которого происходит биосинтез ароматических аминокислот [1, c. 480; 6, c. 370]. Цель данной работы состояла в доказательстве трансгенности для экспрессии гена ароА во всех трансформантах картофеля выросших на канамицине с ПЦР и также сравнение относительного клоичества экспрессии генов, устойчивых к фитопатогенам картофеля во всех растениях картофеля выросщих на различные концентрации глифосата,с ПЦР- реального времени (RT-PCR).

Методы исследования.

Трансформацию проводили векторами, сконструированными на кафедре молекулярной биологии БГУ, несущим селективный ген nptII устойчивости к антибиотику канамицину и целевой ген аroА Dickeya dadantii с одной мутацией, который кодирует измененную енол пирувил шикимат фосфат синтазу, что определяет устойчивость к гербициду глифосату. Для проведения экспериментов по агробактериальной трансформации картофеля, использовали штаммы Agrobacteriumtumefaciens AGL0 и LBA4404. Трансформацию агробактерий проводили методом замораживания-оттаивания [10, c. 184]. Клетки бактерий культивировали на стандартной агаризованной среде LB при температуре 28ºС. В среду добавляли антибиотики тиментин (150 мг/л) для избирательного роста агробактерий и канамицин (25 мг/л) как селективный маркер. Отбор клонов проводился методом ПЦР. Полученные агробактериальные штаммы с необходимыми плазмидами использовались для трансформации растений картофеля.

Трансформация растений картофеля.

Для трансформации картофеля были выбраны сорта Одиссей, Скарб и Ветразь. Для переноса плазмид в агробактерии была проведена прямая трансформация агробактерии методом замороживания-оттаивания [10, c. 184]. Трансформация стеблевых эксплантов картофеля проводилась на проростках 4-недельного возраста (только первые 6 междоузлий, начиная от верхушки). Агробактерии выращиваются в течение 12—15 часов в термостате (28ºС) на среде УЕВ без антибиотиков (ночная культура), экспланты инкубировали в 30 мл жидкой УЕВ, содержащей 1:10 ночной культуры агробактерий в течение 15 мин, затем подсушивают на стерильном фильтре (не пересушивать) и помещали на чашки Петри со средой CIM1(соли MS, витамины по Морелю, сахароза 20 г/л, БАП (6-бензиламинопурин), 1 мг/л, 0,1 мг/л НУК (нафтилуксусная кислота), агар 7 г/л рН 5,8). После 2 дней сокультивации (чашки с эксплантами накрыть листом бумаги) экспланты помещали на среду СIM1, содержащую 150 мг/л тиментина и 25 мг/л канамицина. После 7 дней культивации экспланты переносили на среду SIM1(соли MS, витамины по Морелю, сахароза 20 г/л, 1 мг/л БАП (6-бензиламинопурин), 0,1 мг/л гибберелиновая кислота, агар 7 г/л рН 5,8) с добавлением антибиотика тиментина в концентрации 150 мг/л и селективного агента (канамицина в концентрации 50 мг/л). В дальнейшем экспланты переносили на свежую среду SIM1 каждые 2 недели до появления побегов [3, c. 1590; 4, c. 1195; 7, c. 3].

Для повышения эффективности каллусогенеза использовали контрастную стимуляцию: помещали чашки с эксплантами в темноту на 2 суток при температуре 24—25°^С, переносили на неделю на свет (5000 Лк) на 25°^С с фотопериодом 16/8 часов, далее экспланты переносили на свежую среду SIM1 каждые 2 недели до появления побегов.растения, для образования корней, высаживали на среду MS с добавлением 150 мг/л тиментина, 0,1 мг/л НУК и антибиотика канамицина. После 1—2 пассажей переносили на автоклавированную почву, были выделены ДНК и тотальной РНК для проведения ПЦР, методом [8, c. 432; 9, c. 5].

Подготовка раствора глифосата.

При подготовлении нужных растворов глифосата (N- (фосфонометил)-глицин), 40 мкл жидкого глифосата довести до обьема 4000 мкл дистилированной водой в соотношении 1:100 и затем пресаживали растения на различные концентрации глифосата (0, 1/500, 1/250, 1/100) мкл на 50 мл агаризованной среде MS.

Результаты и обсуждение.

Молекулярный анализ полученных растений.

Наличие гена aroA в геноме растений анализировали с помощью реакций амплификации с праймерами5′-GCCGAATCCCTGACGTTACAACC-3′ и 5′-CCGGCTGCCTGGCTAATCCGCGC-3′, с которыми синтезируется фрагмент размером 750 п.н. Реакционная смесь включала 1 мкл геномной ДНК каждого образца, по 2 мкМ каждого из праймеров, 2 мМ смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 5 единиц/мклTaq полимеразы в однократном реакционном буфере. Общий объем смеси составлял 20 мкл. Программа амплификации: денатурация 94^°С 4 мин; 30 циклов: 94°С 30 с; 55°С 1 мин; 72°С, 1 мин 30 с; заключительный цикл: 7 мин при 72°С. Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в 1 %-ом агарозном геле в трис-ацетатной буферной системе.

кПЦР проводили на амплификаторе ДТ-96 (ДНК-Технология) с модулем детекции продуктов в режиме реального времени. Для определения уровней экспрессии генов растений картофеля использовали прямой и обратный праймеры (Таблица 1), Taq буфер «AM» и Taq полимеразу (2.5 ед.) реакционная смесь объемом 100 мкл содержала каждый праймер в концентрации 0.2 мкл, дНТф — по 0.1 мМ, а также интекалирующий краситель SYBRGreen 1 (Sigma) и референсный краситель ROX (праймтех) в рекомендованных производителем концентрациях. Продукты реакции детектировались в ходе 42 цикла чередующихся темпратур 94^°С (2 мин) и 60^°С (1 мин). Расчеты уровня экспрессии генов проводили по следующей схеме. Определяли разницу значений (∆ Ct), вычитая из конститутивно экспрессирующегося гена EF-1 α пороговое значение (Ct) PR-генов.

Рисунок 1. А — Трансформированные растения картофеля, выросшие на канамицине; В — Элктрофореграмма ПЦР продуктов с праймерами к гену aroA, полученных с ДНК и кДНК выделенной из трансформированного картофеля. Дорожки 1 и 2 (положительный контроль, отрицательный контроль и плазмидная ДНК PZH485), 3 — 7 — образцы ДНК, 8, 9,10 — образцы кДНК, — М — маркерная ДНК (1 kbDNAladderMix, Fermentas)

Рисунок 2. сравнение относительной экспрессии генов между концентраций 0 (контроль) и 1/500

Рисунок 3. сравнение относительной экспрессии генов между концентраций 0 (контроль) и 1/250

Рисунок 4. сравнение относительной экспрессии генов между концентраций 0 (контроль) и 1/100

Одной из целей генной инженерии является получение растений с ценными признаками для сельскохозяйственного производства. Нами была проведена агробактериальная трансформация трех сортов картофеля двумя генетическими конструкциями с геном aroA. Полученные трансформанты культивировали до формирования стеблей и корневой системы на среде Мурасига скуга с канамицином и тиментином. Тиментин добавляли для подавления роста агробактерий. Сформированные растения переносили сначала в стерильную почву в закрытом сосуде для предохранения от пересыхания, а через неделю культивировали в открытом сосуде при естественном освещении. aroA кодирует фермент, EPSPS. Глифосат ингибирует 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазу (EPSPS) растений. EPSPS — фермент шикиматного пути, локализованного в хлоропластах, в результате которого происходит биосинтез ароматических аминокислот. Для выделения ДНК отбирали листья с середины побегов. ПЦР анализ образцов ДНК выявил во всех растениях фрагмент aroA гена размером 750 нуклеотидов. Полученные трансгенные растения после размножения будут анализироваться на устойчивость к глифосату. Глифосат один из наиболее дешевых и безопасных гербицидов. Глифосат также подавляет развитие фитофторы, поэтому кажется перпективным использование глифосата для обработки картофеля от фитофтороза и сорняков.

Список литературы:
1.    Маниатис Т. Молекулярное клонирование / T. Маниатис, Э. Фрич, ДЖ. Сэмбрук // — M: мир. — 1984. — С. 480.
2.    Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия / С.Н. Щелкунов. — Новосибирск: Сибир. Универс. издание. — 2004. — 496 с.
3.    Beaujean A. Agrobacterium-mediated transformation of three economically important potato cultivars using sliced intermodal explants: an efficient protocol of transformation / A. Beaujean, R.S. Sangwan, A. Lecardonnel, BS-Norrel Sangwan // J. Exp. Bot. — Vol. 49. — № 326. — 1998. — P. 1589—1595.
4.    Broglie K. Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani / K. Broglie, I. Chet Holliday, M. Cressman, R. Biddle, P. Knowlton, S. Mauvais, C.J. Broglie // Science. — № 254. — 1991. — P. 1194—1197.
5.    Chang M.M. Agrobacterium-mediated transformation of a pea β-1,3-glucanase and chitinase genes in potato (Solanum tuberosum L.cv. Russet Burbank) using a single selectable marker / M.M Chang, D. Culley, J.J. Choi, L.A. Hadwiger // PlantSci. — № 163. — 2002. — P. 83—89.
6.    Comai L. An altered aroA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate / L. Comai, Sen L.C., Stalker D.M., // science. — 1983. — Vol. 221. — P. 370—371.
7.    Conner A.J, Williams M.K, Gardner R.C, Deroles S.C, Shaw M.L and Lancaster J.E. Agrobacterium-mediated transformation of New Zealand potato cultivars / A.J. Conner, M.K. Williams, R.C. Gardner, S.C. Deroles, M.L. Shaw, J.E. Lancaster // New Zealand J. Crop and Hort. Sci. — № 19. — 1991. — P. 1—8.
8.    Kingston R.E. Current Protocols in Molecular Biology. In: Preparation and Analysis of RNA. Published online January 2010 in Wiley Interscience, 2010. — 431—433.
9.    Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from plant tissues // plant molecular biology manual. 1988. — A6, 1—10.
10.    Transfection and transformation of A. tumefaciens / M. Holsters [et al.] // M GG. — 1978. — Vol. 163. — P. 181—187.