РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРИЗИДОНА В КОМБИНИРОВАННЫХ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТАХ

Туберкулез (ТБ) — это излечимое заболевание, от которого до сих пор ежегодно во всем мире умирает около 1,4 млн человек и которое является основной причиной смертности среди людей, живущих с ВИЧ/СПИД. Из 9,4 млн новых случаев заболевания туберкулезом каждый год 440 тысяч — это пациенты с формами, устойчивыми к нескольким противотуберкулезным препаратам, что означает, что они не поддаются лечению при помощи двух основных антибиотиков, которыми обычно лечится туберкулез. За последние десять лет лекарственно-устойчивый туберкулез (ЛУ-ТБ) развился приблизительно у пяти миллионов человек, однако менее 1% из них имели доступ к адекватному лечению, и полтора миллиона из них погибли [2, с. 15].

Теризидон включен в руководства ВОЗ как бактериостатический препарат второго ряда орального применения Группы 4 — препараты, рекомедованные для лечения лечения активного легочного и внелегочного туберкулеза (включая почечное заболевание), когда вызывающие заболевание организмы чувствительны к этому препарату и когда лечение основными противотуберкулезными препаратами оказалось недостаточным [1, с. 6].

Определение теризидона затруднено тем, что молекула циклосерина обладает высокой полярностью, имеет функциональные группы, которые не чувствительны к ультрафиолетовому поглощению, а также недостаточно стабильна в кислотной среде. Молекула теризидона с течением времени гидролизирует, с образованием двух молекул циклосерина и терефтальдегида [3, с. 37199].

Целью данной работы является разработка быстрой, простой и точной методики определения теризидона в тесте «Растворение» с использованием метода ВЭЖХ, а также сравнение валидационных характеристик предложенной методики по показателям селективности, линейности, правильности, прецизионности.

Методика выполнения анализа.

Испытание проводят в соответствии с требованиями ГФ РК I, т. 2, 2.9.3, используя прибор с корзинкой. Среда растворения – буферный раствор с рН 3.0, объем среды растворения – 500 мл, температура среды растворения – 37 ± 0.5ºС, скорость вращения корзинки – 100 об/мин, время растворения – 45 мин.

Определение проводят методом жидкостной хроматографии (ГФ РК I, т. 1, 2.2.29). Для испытания в корзинку помещают 1 таблетку.

Через 45 мин отбирают 100 мл раствора из центра сосуда для растворения и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0.45 мкм, отбрасывая первые порции фильтрата.

5.0 мл полученного фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора буферным раствором с рН 3.0 до метки и перемешивают (испытуемый раствор).

По 20 мкл испытуемого раствора и 20 мкл раствора сравнения попеременно хроматографируют на жидкостном хроматографе с УФ - детектором, получая не менее 5 хроматограмм для каждого из растворов в следующих условиях:

·     колонка из нержавеющей стали размером 250 мм x 4.6 мм, заполненная силикагелем октадецилсилильным для хроматографии Р с размером частиц 5 мкм или аналогичная;

·     подвижная фаза: ацетонитрил для хроматографии Р1 – буферный раствор с рН 3.0 (20:80), дегазированная любым удобным способом;

·     скорость подвижной фазы – 1.2 мл/мин;

·     детектирование - при длине волны 285 нм;

·     температура колонки - 30^оС;

·     время хроматографирования - 15 мин.

Содержание протионамида (теризидона) (Х), перешедшего в раствор из таблетки, в процентах, вычисляют по формуле:

                                             (1)

где:  – среднее значение площадей пиков протионамида (теризидона), вычисленное из хроматограмм испытуемого раствора;

 – среднее значение площадей пиков протионамида (теризидона), вычисленное из хроматограмм раствора сравнения;

 – масса навески стандартного образца (СО) протионамида (теризидона), в миллиграммах;

 – содержание протионамида (теризидона) в СО протионамида (теризидона), в процентах;

 – содержание протионамида (теризидона), указанное в разделе «Состав на одну таблетку», в миллиграммах.

Приготовление раствора сравнения: 50.0 мг теризидона (СО НД фирмы) и 50 мг протионамида (СО НД фирмы) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл буферного раствора с рН 3.0, нагревают на водяной бане при температуре 40ºС в течение 20 минут, охлаждают и доводят тем же растворителем до метки, перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0.45 мкм.

5.0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки буферным раствором с рН 3.0 и перемешивают.

Приготовление буферного раствора с рН 3.0: 0.5 г натрия октаносульфоната растворяют в 800 мл воды, прибавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты, прибавляют раствор натрия гидроксида 1М до рН 3.0±0.05, доводят объем раствора водой до 1 литра и перемешивают.

Валидация разработанной методики.

Валидацию методики теста «Растворение» проводили в соответствии с Государственной фармакопеей Республики Казахстан [4, с. 100] по следующим характеристикам: селективность, линейность, диапазон применения, сходимость.

Селективность.

Проводили анализ образцов стандартного раствора теризидона и раствора плацебо. На хроматограммах образцов плацебо не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания теризидона. Поскольку проводилось исследование относительно полученного терефтальдегиа, в результате гидролиза теризидона, было указано соответствующее время удерживания пика терефтальдегида. Соответствующие хроматограммы приведены ниже на рисунках 1-3.

Рисунок 1. Хроматограмма раствора плацебо

Рисунок 2. Хроматограмма раствора стандартного образца терефтальдегида

Рисунок 3. Хроматограмма раствора стандартного образца теризидона

Линейность и диапазон применения

Проводили анализ пяти образцов с прибавлением стандартного раствора теризидона до получения следующих концентраций: 0,04 мг/мл, 0,045 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,055 мг/мл, 0,06 мг/мл. По полученным значениям был построен калибровочный график, приведенный на рисунке 4.

Рисунок 4. Калибровочный график стандартного раствора теризидона

Таблица 1.

Построение калибровочного графика стандартного раствора теризидона

Сходимость.

Степень согласования результатов при анализах однородного образца, выполненных одним аналитиком при одних и тех же условиях (реактивы, оборудование, обстановка и др.), и в течение короткого промежутка времени соответствует критерию приемлемости: не более 2 процентов для 6 измерений.

Таблица 2.

Сходимость результатов

Заключение.

Разработана методика определения теризидона в комбинации с протионамидом, используемая в тесте «Растворение» с использованием метода ВЭЖХ с УФ-детектированием. Методика показала высокую чувствительность, точность и воспроизводимость. Данная методика может быть использована на стадии клинических и фармакокинетических исследований новых воспроизведенных лекарственных средств теризидона.

Список литературы:

1. Медикаменты для лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза под микроскопом / ВОЗ / Март 2011 / С.6.

2. Blanc L, Falzon D, Fitzpatrick C, Floyd K, Garcia I, Gilpin C, et al. Global tuberculosis control: WHO report 2010 / Глобальный контроль над туберкулезом.

3. Patel U., Y.P. Yan, F.W. Hobbs, Jr., J. Kaczmarczyk, A.M. Slee, D.L. Pompliano, M.G. Kurilla, E.V. Bobkova. Oxazolidinones Mechanism of Action: Inhibition of the First Peptide Bond Formation / Vol. 276, № 40, Issue of October 5, Р. 37199–37205, 2001

4. Государственная фармакопея Республики Казахстан / Том 1 / С.100