Детекция вируса, дефектного по экспрессии супрессора, в растениях на начальных стадиях инокулирования патогеном

В настоящее время важно уделять внимание проблеме вирусных заболеваний растений в быстро растущем мире. Значительные пагубные последствия влекут за собой заражения семян вирусами и, как следствие, их плодов, являющихся пропитанием для людей. Поэтому необходимо изучать заболевания, в особенности заболевания основных культур, которые употребляются в пищу, а также новые болезни, появляющиеся в современном мире. Несмотря на то, что во многих лабораториях, вирусы определяются их идентификация может быть затруднена, а во многих случаях о зараженности семян просто не догадываются, что приводит, в итоге, к непредсказуемым эффектам.

В качестве защитной реакции у растений выработался механизм, называемый РНК-интерференцией, являющийся одним из важнейших у эукариот.

РНК-интерференция, также известная как умолкание РНК или посттранскрипционное умолкание генов (PTGS-post transcriptional gene silencing) используется в качестве регуляторного механизма, способствующего деградации и трансляционной репрессии, т.е. в качестве защитного механизма против вирусов или инвазивной РНК [1]. Подобное умолкание генов – механизм, свойственный эукариотам, включая растения, грибы, клетки млекопитающих [1, 2, 5, 10, 11, 25]. РНК-интерференция включает в себя разрезание двухцепочечной РНК (дцРНК) при помощи комплекса DICER [2] на короткие интерферирующие РНК (киРНК) длиной 20-25 нт [6, 7]. В дальнейшем дц-киРНК ассоциируются с комплексом RISC (RNA induced silencing complex) и не позволяет распознать одноцепочечную РНК (ssRNA) для последующего ее уничтожения [1, 2, 25].

Для сопротивления подобному умолканию генов у вирусов появилась супрессорная способность к защитному механизму растений [3, 5, 9, 13, 15, 16, 17, 23]. К подобным супрессорам относятся белок Потивируса HC-pro [1, 8], белок Кукумовируса 2b [4], р19 вируса TBSV [12, 20, 24], а также белок оболочки (CP, coat protein) Кармовируса [14, 22], среди приведенных белков имеются и структурные и неструктурные. Независимо от этого, большинство из них схожи в том плане, что ранее они были определены как факторы патогенности или же детерминанты клетки. В качестве примера приведен белок р19 вируса TBSV и родственных вирусов табака, возможно один из наиболее хорошо изученных и имеющих широкое применение супрессоров [18, 19, 21]. Также и в нашей работе мы использовали данный белок p19, инокулировав образцы растений N. benthamiana для последующей диагностики.

Материалы и методы исследования. Для переноса транскриптов с агарозного геля на нитроцеллюлозную, либо нейлоновую мембрану используются первичные и вторичные антитела с меченным ферментом к транскриптам TBSV, на месте успешного связывания которых появятся бэнды.

Для проверки образования cross linking нитроцеллюлозная, либо нейлоновая мембрана аккуратно переносится под ультрафиолет в трансиллюминатор на 10 мин. Мембрана кладется в посуду, в которую заливается Blocking Solution. Blocking Solution применяется для закрытия свободных пор, а те участки, где прошел cross linking останутся без изменений. Буфер выливается, и мембрана заливается первичными антителами, которые связываются с соответствующими антигенами. Затем заливаются вторичные меченные антитела, которые связываются уже с имеющимися первичными антителами на мембране. Меченные вторичные антитела проявляют флуоресцирующие свойства при реакции с NBT BCIP. Комбинация из NBT (nitro-bluetetrazoliumchloride) и BCIP (5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphatep-toluidinesalt) продуцирует интенсивный, нерастворимый темно-фиолетовый осадок, когда реагирует с щелочной фосфатазой, и широко применяется в качестве конъюгата для антител.