Методика получения накопительных культур Lactobacillus с применением металлооксидных наноструктур

The method of obtaining enrichment culture of Lactobacillus using metal oxide nanostructures

Natalia Sidorova

candidate of Biological Sciences, assistant professor, Petrozavodsk State University - PetrSU, Russia, Petrozavodsk

Alina Vasilyeva

student, Petrozavodsk State University - PetrSU, Russia, Petrozavodsk

Olga Berezina

Сandidate of Physical and Mathematical Sciences, assistant professor, Petrozavodsk State University - PetrSU, Russia, Petrozavodsk

Nadezhda Markova

Senior Lecturer, Petrozavodsk State University - PetrSU, Russia, Petrozavodsk

Аннотация. Цель работы – разработка методики получения накопи­тельной культуры Lactobacillus acidophilus с ускоренным синтезом вторичных метаболитов. Эффект достигается за счет иммобилизации на полимерном носителе, модифицированном за счет включения оксидов металлов.

Abstract. The purpose is to develop a method for obtaining a storage culture of Lactobacillus acidophilus with accelerated synthesis of secondary metabolites. The effect is achieved due to immobilization on a polymeric carrier, modified due to the inclusion of metal oxides.

Ключевые слова: пробиотики; биотехнология; иммобилизация; оксиды металлов; поливинилпирролидон.

Keywords: probiotics; biotechnology; immobilization; metal oxides; polyvinylpyrrolidone.

В биотехнологии пробиотических культур принцип закрепления, покрытия или иммобилизации клеток на органических или неоргани­ческих носителях используется для создания биологически активных препаратов, обладающих высокой степенью стабильности и эффектив­ности [1, c. 128]. Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ перед свободными клетками и иммобилизованными ферментами в большей активности, стабильности и требуют гораздо меньше экономи­ческих затрат на получение [2, c. 34]. Предложен вариант иммобилизации за счет адсорбции микробных клеток на матрице наноструктури­рованного полимера за счет комплекса физических и химических реакций. Повысить эффективность технологии можно за счет модификации полимерного носителя включением в его структуру оксидов металлов. Для разработки метода получения накопительных культур Lactobacillus acidophilus и оптимизации процесса биосинтеза вторичных метаболитов лактобактериями использована чистая культура посевного материала штамма 317/402 Ep.n. v. «НАРИНЭ ААА», выде­ленная из фармакопейных пробиотических препаратов и иммобилизо­ванная нанонитями поливинилпирролидона (PVP). В экспериментах использованы 2 варианта PVP: PVPI и PVPII (с добавлением ZnO). Для синтеза нитей PVPI был приготовлен прозрачный раствор путем смешивания высокомолекулярного поливинилпирролидона (M_r = 1,3´10⁶ г/моль) с дистиллированной водой при комнатной темпе­ратуре из расчета 0,13 г/мл. Для синтеза нитей PVPII был приготовлен раствор путем смешивания раствора ацетата цинка двух водного (Zn(CH₃COO)₂´2H₂O) в дистиллированной воде и раствора высоко­молекулярного PVP (M_r = 1,3´10⁶ г/моль) в этаноле.

Иммобилизация клеток L. acidophilus осуществлялась за счет обра­зования ковалентных связей с активированным носителем на поперечной сшивке клеток за счет активных групп в клеточной стенке [3, c. 198]. Оксидные наноструктуры, как потенциальные носители для иммоби­лизации лактобактерий, вносили непосредственно в ростовую среду в количестве 0,0751 г (PVP1) и 0,0889 г (PVPII).

Метаболическую активность иммобилизованных штаммов Lactobacillus acidophilus оценивали по ферментативной активности и образованию DL-молочной кислоты с помощью титруемой кислот­ности (Т°) в соответствии с ГОСТ 3624. Титруемая кислотность показывает количество кубических сантиметров децинормального (0,1 N) раствора щёлочи, израсходованных на нейтрализацию 100 см³ молока с двойным объёмом дистиллированной воды в присутствии инди­катора фенолфталеина. Момент окончания титрования это появление слабо-розового окрашивания, которое не исчезает в течение 1 минуты. Присутствие DL- молочной кислоты определяли качественной реакцией. Предварительно готовили 2 мл центрифугата, которые смешивали с 5 мл H₂SO₄ и 1 мл CuSO₄´5H₂O. Смесь нагревали на водяной бане при 100° С в течение 5 минут. После охлаждения добавляли 1 мл 0,2 % раствора тиофена. В присутствии молочной кислоты раствор окрашивался в малиново-красный цвет.

В процессе ферментации молочного сахара под действием лактазы иммобилизованных клеток Lactobacillus acidophilus оценивали динамику показателей рН и окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) культуральной среды, которые являются технологи­ческими параметрами и контролируют направление биохимических процессов в культуральной среде.

В течение 30 суток эксперимента численность живых стабилизи­рованных PVP лактобактерий оставалась на очень высоком уровне. Количество связанных с матрицей PVP клеток бактерий существенно отличалось от свободных вариантов и превышало контрольные зна­чения в эксперименте с использованием PVPI и PVPII с оксидом цинка. При этом, число жизнеспособных клеток L. acidophilus в условиях иммо­билизации PVPI к концу эксперимента увеличилось от 3,4 ´ 10⁴ КОЕ/мл до 7,4 ´ 10⁸ КОЕ/мл, а в условиях иммобилизации PVPII с ZnO - от 3,1 ´ 10³ КОЕ/мл до 4,1 ´ 10⁷ КОЕ/мл. Свободные от PVP клетки достигли максимума численности к 20 суткам эксперимента - 3,4 ´ 10⁵ КОЕ/мл, а через 10 суток их количество сократилась до 2,5 ´ 10⁵ КОЕ/мл (табл. 1).

Таблица 1.

Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) L.acidophilus в опыте и контроле

Обработка лактобактерий поливинилпирролидоном существенно сказалась на метаболической активности молочнокислых бактерий, о чем свидетельствуют значения рН (3,10 и 3,80), которые установились в опытных культуральных средах к 30 суткам эксперимента. В контроле накопление молочной кислоты и, как следствие, уменьшение рН среды наблюдалось не так интенсивно, и к концу эксперимента составило всего 4,50 (табл. 2). Важно отметить, что низкие значения рН в опыте с PVPI и PVPII с ZnO не вызвали ингибирование роста бактерий и их численность продолжала последовательно увеличиваться. Окислительно-восстановительный потенциал культуральной среды в условиях опыта с PVPI увеличивался от +102 мВ до +360 мВ, а с PVPII - от +90 мВ до +342 мВ. В контроле, при культивировании лактобактерий без оксидных наноструктур увеличение ОВП наблюдалось только в тече­нии 20 суток эксперимента (от +72 мВ до +203 мВ), а к 30 суткам - окислительно-восстановительный потенциал культуральной среды снизился до +169 мВ.

Таблица 2.

Динамика рН и ОВП культуральной среды в опыте и контроле

Примечание: * - показатели рН, ** - показатели ОВП

Динамика показателей титруемой кислотности (Т°) представлена в таблице 3.

При изучении метаболической активности иммобилизованных штаммов Lactobacillus acidophilus во всех вариантах эксперимента при постановке качественной реакции с H₂SO₄, CuSO₄ ´ 5Н₂О и раствором тиофена, доказано присутствие DL-молочной кислоты. Более всего феномен изменения цвета раствора проявлялся в опыте с PVPII, а менее интенсивно – в контроле. Значительное увеличение титруемой кислотности зарегистрировано в опыте с использованием PVPI, за 30 суток эксперимента она увеличилась в 3,9 раз, в случае с PVPII - титруемая кислотность увеличилась в 3,1 раза, в а в контроле – в 2, 6 раз.

Таблица 3.

Титруемая кислотность культуральной среды в опыте и контроле

По результатам проведенных исследований можно выдвинуть предложение по оптимизации технологии иммобилизации пробиоти­ческих культур. В серии экспериментов с использованием поливинил­пирролидона и оксида цинка доказано, что иммобилизованные клетки Lactobacillus acidophilus штамма 317/402 Ep.n. v. «НАРИНЭ ААА» по сравнению со свободными обладают меньшей активностью, что обеспечивает быстрое накопление метаболитов, контролирующих интенсивность гомоферментативного брожения. В течение 30 суток эксперимента популяция иммобилизованных клеток сохраняла большее количество жизнеспособных особей, чем лактобактерии, растущие в жидких суспензионных культурах.