Исследование общей цитотоксичности противомикоплазменного антибиотика новостимина в культурах клеток почек млекопитающих

Research of the general cytotoxicity of the anti-mycoplasma antibiotic novostinin in cell cultures kidney of mammals

Maxim Doronin

Candidate of Biological Sciences, Researcher, Federal Center for Animal Health, Russia, Vladimir

Vyacheslav Starikov

Candidate of Veterinary Sciences, Leading Researcher, Federal Center for Animal Health, Russia, Vladimir

Marina Guseva

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Federal Center for Animal Health, Russia, Vladimir

Julia Elkina

PhD student, Federal Center for Animal Health, Russia, Vladimir

Dmitry Mikhalishin

Candidate of Veterinary Science, Head of Laboratory, Federal Center for Animal Health, Russia, Vladimir

Аннотация. Проведена оценка общей цитотоксичности новостимина в клеточных линиях из почек млекопитающих. Определены оптимальные концентрации антибиотика, применяемого для профилактики культур клеток от микоплазм.

Abstract. The assessment of the general cytotoxicity of a novostimin in cell lines from a kidney of mammals is carried out. Optimum concentrations of the antibiotic applied to prevention of cell culture from mycoplasmas are defined.

Ключевые слова: микоплазма; цитотоксичность; новостимин; клетки почек млекопитающих; интенсивность прироста клеток.

Keywords: mycoplasma; cytotoxicity; novostinini; cells of a kidneys of mammals; index of a proliferation.

Введение. Микоплазмоз – воспалительное инфекционное заболева­ние млекопитающих, которое развивается при размножении микро­организмов семейства Mycoplasmatacea, рода Mycoplasma. Микоплазмы часто входят в состав постоянной флоры слизистых оболочек верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, почек, половых путей и вызывают системную инфекцию в случае развития иммунодефицитов и иммуносупрессий. Возбудители микоплазмозов адгезируются на плазмалемме клетки хозяина, поглощая из нее необходимые анаболиты и факторы роста. Продукты жизнедеятельности микоплазм, в том числе пероксид водорода и аммиак, вызывают развитие цитотоксического действия и деструкцию тканей, что приводит к нарушению функций органов [5].

По данным многолетних исследований микоплазмы устойчивы к действию пенициллинов, сульфаниламидов, стрептомицина, при этом чувствительны к влиянию антибиотиков тетрациклинового ряда, макролидам и фторхинолонам [2, 5]. Однако возбудители микоплазмозов быстро мутируют, что актуализирует проблему поиска новых антибакте­риальных препаратов с высокой активностью против микоплазм. Среди антибиотиков нового поколения особое место отводят ново­стимину, обладающему высокой эффективностью в отношении широкого спектра микроорганизмов, в том числе микоплазм.

Новостимин, или бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил] аммоний хлорид моногидрат является четвертичным аммонийным соединением, относящимся к группе катионных поверхностно-активных веществ. Препарат обладает выраженным противомикробным и противо­воспалительным действием, активен в отношении большинства вирусов, бактерий, грибов и простейших. Механизм действия антибиотика заключается в процессе активного взаимодействия препарата с белками и липопротеинами плазматической мембраны микробной клетки, что приводит к ее некрозу [2, 3].

При оценке возможности применения антибиотиков в медицине и ветеринарной практике проводят исследование общей цитотоксичности соединения в клеточных линиях. Под данным явлением понимают появление клеточных изменений, которые могут выражаться в виде цитостатичности с нарушением клеточного цикла, либо в появлении цитоцидного эффекта с последующей гибелью клеток [2, 5]. Токсическое действие антибактериальных препаратов может инициировать апоптоз с агрегацией и фрагментацией эукариот, а также некроз, при котором происходит увеличение размеров и дальнейшая дезинтеграция клеток [4].

Для оценки токсичности препаратов в настоящее время широко применяют методы, альтернативные классическим исследованиям на лабораторных животных, а именно, применение в качестве тест-систем монослойных культур клеток. Учитывая, что большинство микоплазм поражают органы мочеполовой системы, то для оценки цитотоксичности указанных антибиотиков в качестве тест-систем возможно использование клеток почек разных млекопитающих.

При анализе научных публикаций авторами не были обнаружены сведения об оценке базовой цитотоксичности новостимина в клеточных линиях из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), свиньи (IB-RS-2) и горного сибирского козерога (ПСГК-30). Исходя из этого, актуально провести исследование общей цитотоксичности данного антибиотика в монослойных клеточных линиях ВНК-21, IB-RS-2 и ПСГК-30.

Материалы и методы. Тест-системы. Для определения базовой цитотоксичности новостимина в качестве тест-систем применяли монослойные культуры клеток BHK-21, IB-RS-2 и ПСГК-30 с посевной концентрацией 2·10⁵ - 3·10⁵ клеток/см³.

Антибиотик. В работе использовали антибиотик новостимин (бензилдиметил[3-(миристоиламино)пропил] аммоний хлорид моногидрат) (ООО «Скандия Эко», РФ) со следующими концентра­циями: 2, 5, 7, 10, 20, 30, 50 мкг/см³.

Контроли. Для исследования использовали следующие контроли: 1) контроль без антибиотика, представляющий собой монослой клеток ВНК-21, IB-RS-2 и ПСГК-30 в ростовой среде классического состава без внесения антибиотиков; 2) контроль с антибиотиками, в качестве которого использовали клеточные монослои указанных выше культур, выращенных в питательной среде, содержащей набор антибиотиков с концентрациями: бензилпенициллин (90 мкг/см³), неомицин (175 мкг/см³) и нистатин (10 мкг/см³) [5].

Культивирование клеток. Монослойное культивирование клеток линий BHK-21, IB-RS-2, ПСГК-30 проводили в ростовой среде, содержащей комплекс аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов в сочетании с 5,0% эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота. Пересев клеток проводили через каждые 48 ч в течение 5 последо­вательных пассажей. Для диспергирования клеточного монослоя при пересеве использовали смесь из 0,02% версена и 0,25% трипсина в соотношении 1:3.

Количественный метод оценки действия антибиотиков на культуру клеток. Действие антибиотиков на клеточные линии определяли по их влиянию на жизнеспособность клеток. Анализ заключался в подсчете количества живых и мертвых клеток с помощью счетной камеры Горяева с использованием 0,4% изотонического раствора трипанового синего. Интенсивность роста определяли по кратности прироста (КП) с помощью формулы: КП = С₄₈/С₀, где С₄₈ – количество (в см³) живых клеток через 48 ч после посева, С₀ – посевная концентрация клеток. Полученные значения КП клеток с среде с новостимином сравнивали с контрольными данными.

Оценка морфологического состояния клеток. Для исследования влияния антибиотика в разных концентрациях на клеточные линии проводили оценку морфологического состояния клеток, а также монослоя в сравнении с контролями.

Исследование проб на стерильность. Тесты на контаминацию микоплазмами, бактериями и грибами проводили с использованием стандартного набора питательных сред: соево-казеиновый агар, мясо-пептонный бульон, тиогликолевая среда.

Статистическая обработка данных. Исследование проводили в трех повторностях. Вычисляли средние арифметические значения, степень достоверности статистической разницы между средними величинами, определенными по разностному методу Стьюдента-Фишера [1]. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,005.

Результаты исследования. На первом этапе исследования проводили количественную оценку токсического действия новостимина в концентрациях 2, 5, 7, 10, 20, 30, 50 мкг/см³ на клетки монослойных линий ВНК-21, IB-RS-2, ПСГК-30 в течение 5 последовательных пассажей. Спустя 48 ч после каждого пассажа определяли КП клеток в экспериментальных пробах и проводили сравнительный анализ полученных данных с контрольными образцами. Результаты исследо­вания по определению КП отражены в таблице 1.

Определены средние значения КП клеток в контрольных образцах на протяжении 5 пассажей: для клеток линии ВНК-21 кратность прироста в контроле без антибиотика (КП_Кб/а) составила 4,62±0,08, кратность прироста в контроле с антибиотиками (КП_Ка) – 3,59±0,07, для культуры клеток IB-RS-2 КП_Кб/а была равна 3,82±0,06, КП_Ка – 3,50±0,04, для линии клеток ПСГК-30 КП_Кб/а соответствовала значениям 4,17±0,03, КП_Ка – 3,47±0,04. Экспериментально определили концентрации новостимина, при которых кратность прироста клеток в опытных группах была выше по сравнению с контролем, содержащим стандартный набор антибиотиков, и ниже, чем в контроле без антибактериальных препаратов.

Так, при тестировании новостимина с содержанием активного вещества от 2 до 5 мкг/см³ КП_ВНК-21 составляла 4,26±0,13 – 3,96±0,18 (>3,59±0,07), КП_ПСГК-30 – 4,03±0,12 – 3,70±0,10 (>3,47±0,04). Величина КП_IB-RS-2 находилась в диапазоне 3,80±0,18 – 3,76±0,10 (>3,50±0,04) при дозе новостимина 2 мкг/см³. Полученные значения КП для исследуемых культур свидетельствовали о высокой пролиферативной активности клеток при использовании новостимина в количестве до 5-7 мкг/см³.

Таблица 1

Влияние количества новостимина на кратность прироста клеток линий ВНК-21, IB-RS-2, ПСГК-30 (p<0,005)

В ходе анализа были определены предельно допустимые концен­трации новостимина, при которых значения КП клеток применяемых тест-систем находились на уровне с контролем, содержащим комплекс антибиотиков. Так, КП_ВНК-21 составляла 3,61±0,10 – 3,60±0,06 (не ниже 3,59±0,07) и КП_ПСГК-30 находилась в диапазоне от 3,65±0,14 до 3,52±0,08 (не ниже 3,47±0,04) при концентрации новостимина 7 мкг/см³.

Для культуры клеток IB-RS-2 допустимым было содержание данного антибиотика в количестве не выше 5 мкг/см³ (КП_IB-RS-2 составляла 3,68±0,12 – 3,58±0,09, не ниже 3,50±0,04).

Как следует из таблицы, при более высоких концентрациях новостимина отмечали значительное снижение кратности прироста клеток исследуемых линий. Содержание новостимина, равное 7 мкг/см³, при выращивании монослоя IB-RS-2 вызывало гибель клеток на 5,4-8,3% в сравнении с контролем антибиотиков. При 10 мкг/см³ новостимина по сравнению с тем же контролем кратность прироста клеток ВНК-21 снижалась на 17,8-30,4%, IB-RS-2 – на 18,6-24,9%, ПСГК-30 – на 12,0-23,4%. Содержание новостимина в ростовой среде в количестве 20 мкг/см³ в сравнении с контролем антибиотиков вызывало падение КП_ВНК-21 на 42,9-51,5%, КП_IB-RS-2 на 35,7-42,3%, КП_ПСГК-30 на 38,0-50,4%. Доза новостимина, равная 50 мкг/см³, ингибировала рост и развитие клеток линии ВНК-21 на 79,9-91,4%, IB-RS-2 на 82,0-93,4%, ПСГК-30 на 75,8-90,2%.

Следующий этап исследования был посвящен оценке морфологи­ческого состояния монослоя и клеток линии ВНК-21, IB-RS-2, ПСГК-30. Применение ростовой среды, не включающей в свой состав анти­бактериальные препараты, а также содержащей классический набор антибиотиков или новостимин с дозами до 10 мкг/см³, позволяло выращивать 95-100% клеточный монослой за 48 часов без возникно­вения цитотоксического эффекта. При увеличении дозы антибиотика от 20 до 50 мкг/см³, наблюдали значительное снижение интенсивности формирования монослоя, агрегацию и деструктивные изменения клеток с выраженными признаками некроза.

По результатам исследования на стерильность все контрольные и экспериментальные образцы не были контаминированы бактериями, грибами и микоплазмами.

Заключение. Проведена оценка общей цитотоксичности ново­стимина в клеточных линиях из почек млекопитающих. Выявлено, что оптимальная концентрация новостимина, которая не оказывает цитотоксического эффекта и не ингибирует процессы роста и развития клеток относительно контрольного образца составляет 7 мкг/см³ для монослойных клеточных линий BHK-21 и ПСГК-30 и 5 мкг/см³ для культуры клеток IB-RS-2.