ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СЛИВОЧНОГО МАСЛА МЕТОДОМ РАТИОМЕТРИЧЕСКОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ЦВЕТОМЕТРИИ

QUALITY ASSESSMENT OF BUTTER BY RATIOMETRIC FLUORESCENCE COLORIMETRY

Mushnichenko Vladimir Valterovich

Independent researcher, Russia, Oryol

Аннотация. Разработан экспресс-метод выявления фальсификации сливочного масла растительными маслами на основе регистрации флуоресценции камерой смартфона. Установлена зависимость отношения интенсивностей каналов B/G от содержания оксилипинов в образце. Определены пороговые значения аналитического сигнала для достоверной классификации продуктов. Показана возможность адаптации метода для различных моделей смартфонов, что перспективно для его широкого применения.

Abstract. An express method for detecting butter adulteration with vegetable oils based on fluorescence detection using a smartphone camera has been developed. A correlation between the B/G channel intensity ratio and the oxylipin content in the sample was established. Threshold values of the analytical signal for reliable product classification were determined. The feasibility of adapting the method to various smartphone models has been demonstrated, indicating its potential for broad application.

Ключевые слова: сливочное масло, фальсификация, растительные масла, флуоресценция, смартфон, оксилипины, экспресс-метод, межприборная калибровка.

Keywords: butter, adulteration, vegetable oils, fluorescence, smartphone, oxylipins, express method, inter-device calibration.

Введение

Развитие методов флуоресцентного экспресс-контроля качества сливочного масла обусловливает переход от субъективных органолептических оценок к объективной цифровой RGB-цветометрии флуоресценции. Эффективность данного подхода зависит от учета известных  [1] флуоресцентных характеристик собственных флуорофоров продукта и маркерных флуорофоров растительных масел, используемых для фальсификации.

Известно, что чистые липиды в диапазоне возбуждения 365–380 нм флуоресцируют слабо [2] тогда как окисленные липиды (основания Шиффа, оксилипины) [1] обладают интенсивной флуоресценцией в диапазоне 400–480 нм. Рибофлавин, как природный маркер молочной продукции [3], даёт наиболее интенсивный сигнал с максимумом 525 нм [1], формируя жёлто-зелёную компоненту спектра.

Молочный жир содержит полиненасыщенные жирные кислоты (далее ПНЖК) (линолевую, альфа-линоленовую кислоту, арахидоновую), которые, несмотря на относительно невысокое процентное содержание, обладают высокой реакционной способностью. Их цепной процесс автоокисления при контакте молока, сливок и сливочного масла с кислородом воздуха приводит к образованию гидропероксидов [4], распадающихся с образованием альдегидов, кетонов и формированием конъюгированных еновых структур, оснований Шиффа и других сложных гетероциклических соединений (далее оксилипинов), обладающих интенсивной флуоресценцией в сине-фиолетовой и ближней УФ-области. Концентрация оксилипинов возрастает в процессе производства и хранения [5]. То есть даже в самом свежем, полученном из натуральных сливок, сливочном масле всегда присутствует определённое количество оксилипинов.

Приоритетным методом фальсификации сливочного масла [6] служит замена части молочного жира на растительные масла и их гидрированные модификации, содержащие trans-изомеры жирных кислот. Типичная степень такой фальсификации варьирует в пределах 30–70% от общей массы жировой фазы [7].

Для выявления суррогатов, получаемых путём замены молочного жира на растительные масла, требуется метод, способный дифференцировать флуоресцентные характеристики животных и растительных липидов на основе подтвержденных характеристик надёжных флуоресцентных маркеров, обеспечивающих достоверное различие молочного жира и растительных масел, применяемых для фальсификации сливочного масла.

Растительные масла, используемые для фальсификации сливочного масла, характеризуются повышенной флуоресценцией в оксилипиновой зоне (430–490 нм) вследствие двух факторов: более высокого содержания ПНЖК (≈10,5 % против ≈4 % в молочном жире) [8], обусловливающего интенсивное образование оксилипинов [9, 2], и более длительного контакта с кислородом в логистической цепочке (≥30 суток эффективного окисления против 2–3 суток для масла). Гидрогенизированные модификации с содержанием trans-изомеров 20–50 % также генерируют флуоресцирующие оксилипины, несмотря на пониженную реакционную способность trans-форм.

Таким образом, повышенная флуоресценция в диапазоне 430–490 нм служит объективным индикатором фальсификации, позволяющим надёжно различать продукты на основе молочного и растительного жиров. Однако для осуществления таких измерений требуется дорогостоящее лабораторное оборудование со стандартизированными условиями измерений, что делает этот метод контроля качества недоступным для широких слоёв населения и учреждений социального питания, не смотря на высокий процент фальсифицированных молочных продуктов [10].

Рибофлавин (витамин B₂) — водорастворимый витамин и эндогенный флуорофор молока, неотъемлемый компонент коровьего молока, который служит биомаркером его аутентичности и качества. Содержание рибофлавина в коровьем молоке составляет 0,17–0,20 мг/100 г и варьирует под влиянием нескольких факторов: породы животных молочного стада, состава его рациона и сезона года, географического региона, физиологических стадий коров и технологических обработок молока [11, 12, 13], что приводит к выраженной сезонной цикличности его концентрации в молоке. Эти факторы, обуславливающие влияние на цикличность содержания рибофлавина, должны приниматься во внимание, чтобы минимизировать ложноположительные результаты при флуоресцентном скрининге фальсификации.

Спектральная калибровка сенсора смартфона

Люминесцентный анализ в люминоскопе — наиболее распространённый экспресс-метод контроля сливочного масла. Визуальное сравнение цвета флуоресценции с эталоном ограничено аддитивным смешением сигналов оксилипинов (430–490 нм) и рибофлавина (~520 нм), что позволяет надёжно детектировать лишь грубую фальсификацию. Частичная замена молочного жира (на уровне спредов) часто остаётся неразличимой, а «более тёплый или холодный» оттенок флуоресценции, как будет показано далее, может приводить к ложноположительным заключениям.

Для цифровой RGB-цветометрии флуоресценции сливочного масла в условиях отсутствия специализированного оборудования перспективно использование смартфонов [14] для регистрации и обработки изображений флуоресценции. Регистрация сигнала в трёх спектральных каналах (R, G, B) видимого диапазона позволяет проводить селективную оценку интенсивности флуоресценции.

Однако для корректной интерпретации сигналов флуорофоров — оксилипинов и рибофлавина — обязательным требованием является точное сопоставление их спектров излучения со спектральной чувствительностью камеры смартфона, используемой в эксперименте, в диапазоне 430–550 нм.

Спектральная чувствительность матриц смартфонов является критическим параметром при разработке методов цветометрического анализа, в частности для оценки флуоресценции молочных продуктов. Однако производители, как правило, не публикуют данные о спектральных характеристиках фотосенсоров, что вынуждает исследователей экспериментально определять эти параметры для каждой используемой модели.

Наиболее точным и доступным методом определения спектральной чувствительности матрицы смартфона является прямое измерение отклика сенсора на монохроматическое излучение [15].

С этой целью с помощью монохроматора на базе схемы Theremino Spectrometer был зарегистрирован спектр комбинированного излучения галогеновой лампы (50 Вт, 2700 К, непрерывный спектр) и ртутной бактерицидной лампы с характеристическими линиями эмиссии ртути с длинами волн 435,8 нм и 546,1 нм, использованных в качестве реперных точек для калибровки шкалы длин волн. Излучение проходило через фторопластовую плёнку толщиной 100 мкм для обеспечения равномерного рассеяния и аттенюации сигнала, затем через оптическую щель шириной 0,1 мм. Регистрация спектра осуществлялась камерой смартфона Redmi 10C через приложение Camera FV-5 Lite (версия 5.3.7) при фиксированной установке баланса белого «дневной свет».

Обработка фотографии спектрограммы включала вертикальное усреднение значений каналов R, G и B по 100 пикселям в каждом из 584 столбцов матрицы (вдоль направления дисперсии в диапазоне 405–650 нм) и привязку номеров пикселей к длинам волн по маркерным линиям эмиссии ртути (волн 435,8 нм и 546,1 нм). Затем была произведено усреднение результатов по пяти повторным снимкам.

Данный подход позволил получить индивидуальную спектральную чувствительность каналов R, B и G камеры в единицах «цифровой отклик/нм» показанную на рис.1.

Рисунок 1. Калибровка спектральной шкалы и определение чувствительности камеры: спектр комбинированного излучения галогеновой лампы и спектра ртутной бактерицидной лампы, зарегистрированный камерой Redmi 10C

Рисунок 2. Сглаженные кривые спектральной чувствительности каналов B и G камеры Redmi 10C с выделенными областями перекрёстной чувствительности: а — область регистрации сигналов G-канала в спектральном диапазоне B-канала, б — область регистрации сигналов B-канала в спектральном диапазоне G-канала

На рис. 2 представлены сглаженные кривые спектральной чувствительности каналов B и G. Как видно из графика, наблюдается перекрёстная чувствительность: сигналы G-канала регистрируются в коротковолновой области (479–494 нм), характерной для B-канала, тогда как сигналы B-канала регистрируются в более длинноволновой области (494–512 нм), соответствующей спектральному диапазону G-канала. Точка пересечения кривых чувствительности (494 нм) определяет границу условного разделения каналов. Данное спектральное перекрытие необходимо учитывать при ратиометрической обработке данных.

Экспериментально полученные зависимости спектральной чувствительности демонстрируют высокую степень сходства с данными, представленными в исследованиях [16], что указывает на использование стандартизированных цветовых фильтров Байера в большинстве коммерческих матриц смартфонов [17].

Спектральные характеристики флуорофоров молочных продуктов

Для регистрации спектров флуоресценции была разработана экспериментальная установка (см. рис 3), включающая:

— три светодиода (λ = 365 нм, мощность 3 Вт) с УФ-фильтрами из стекла Вуда в качестве источников возбуждения;

— длинноволновый отсекающий фильтр (cut-off λ = 400 нм), блокирующий рассеянное излучение возбуждения и пропускающий флуоресценцию в видимой области;

— проекционную оптику, формирующую изображение флуоресцирующего образца на входной щели монохроматора (ширина 0,1 мм);

— отражательную дифракционную решётку с плотностью 1350 штрихов/мм для спектрального разложения излучения;

— USB-модуль монохромной камеры OV9281 (разрешение 1280 × 800 пикселей) с глобальным затвором (global shutter) в качестве детектора.

Рисунок 3. Схема экспериментального флуориметра для регистрации спектров флуоресценции: 1 - камера OV9281, 2 - исследуемый образец, 3 - полипропиленовая ёмкость для исследуемых образцов, 4 - объектив, 5 - УФ светодиод с фильтром  из стекла Вуда, 6 – длинноволновый, УФ отсекающий фильтр, 7 - оптическая щель, 8 - дифракционная решетка

Обработка спектров выполнялась в программе Theremino Spectrometer с калибровкой спектральной шкалы по реперным линиям ртутной лампы (405, 436, 546 нм). Разрешение экспериментального флуориметра составило 1,8 нм (FWHM по линии 436 нм), дисперсия — ≈ 0,213 нм/пиксель.

Для подавления высокочастотного шума применено пространственное сглаживание (параметр Spatial averaging = 10, коэффициент фильтра K = 0,1).

Для визуализации и сравнительного анализа интенсивность флуоресценции нормировалась по степенному закону. В интерфейсе программы установлены значения: логарифмическая шкала = −5, пространственное сглаживание = 10. На графиках по оси ординат отложена нормализованная интенсивность: I_norm (γ = 10,5), % (здесь и далее по тексту).

Рисунок 4. Спектры флуоресценции образцов сливочного масла и маргарина (возбуждение 365 нм): 1 — маргарин «Хозяюшка» (жирность 72,5 %, АО «Нижегородский МЖК», г. Нижний Новгород), 2 — масло сливочное «Milky Time» (жирность 72,5 %, ООО «Амстердам», г. Курск), 3 — масло сливочное «Традиционное» (жирность 82,5 %, ООО «Ливенский маслозавод», Орловская обл.)

Полученные с помощью экспериментального флуориметра спектры флуоресценции качественного сливочного масла проверенного производителя и использованного в качестве модельного фальсификата маргарина показаны на рис 4.

С целью получения спектра флуоресценции оксилипинов молочного жира без маскирующего влияния флуоресценции рибофлавина образец сливочного масла жирностью 72,5 % (производитель — Болховский сыродельный комбинат) был подвергнут фотодеградации под действием излучения массива из восьми светодиодов мощностью 3 Вт каждый (λ = 450 нм). Данный подход является неинвазивным и не влияет на другие флуоресцирующие компоненты, поскольку фотоокисление ПНЖК с образованием регистрируемых оксилипинов проявляется в спектрах флуоресценции с временной задержкой около 5 суток [18]. Для предотвращения плавления образца в процессе облучения ёмкость с маслом была помещена в водяную баню с температурой ниже 10 °C.

Рисунок 5. Динамика спектров флуоресценции сливочного масла в процессе фотодеградации рибофлавина (λвозб = 450 нм): 1 — 0 мин, 2 — 60 мин, 3 — 97 мин, 4 — 133 мин, 5 — 141 мин, 6 — 146 мин.

На рис. 5 показаны этапы фотодеградации периодически снимаемые на экспериментальном флуориметре. Увеличение интенсивности флуоресценции оксилипинов в процессе фотодеградации не происходило – для наглядности спектры нормализованы по наивысшей точке флуоресценции спектра.

Рисунок 6. Спектральное согласование флуорофоров молочных продуктов и каналов B/G матрицы смартфона: 1 — кривая чувствительности B-канала, 2 — кривая чувствительности G-канала, 3 — спектр флуоресценции молока «Пармалат» (жирность 0,05 %), 4 — спектр флуоресценции молочного жира

На рис. 6 представлены спектры флуоресценции основных флуорофоров сливочного масла. В качестве модельного образца рибофлавина использовано обезжиренное молоко (Молоко питьевое безлактозное ультрапастеризованное "Parmalat" 0,05% жирности, АО " Белгородский молочный комбинат"), поскольку максимум спектра флуоресценции рибофлавин-5'-мононуклеотида в дистиллированной воде сдвинут в длинноволновую область на ~5 нм.

Сравнение спектров флуоресценции флуорофоров молочных продуктов с кривыми спектральной чувствительности матрицы смартфона показывает, что точка пересечения кривых флуоресценции оксилипинов и рибофлавина находится в области близкой к точке пересечения кривых спектральной чувствительности B-  и G-каналов.

Важно отметить следующее спектральное согласование:

• пик флуоресценции рибофлавина (~520–530 нм) совпадает с максимумом чувствительности G-канала (~525 нм),

• пик флуоресценции оксилипинов молочного жира (440–485 нм) перекрывается с максимумом чувствительности B-канала (450–485 нм).

Такое совпадение обеспечивает максимальное усиление аналитического сигнала от каждого флуорофора в соответствующем цветовом канале и высокую дифференциацию сигналов: рибофлавин регистрируется преимущественно зелёным каналом, оксилипины — преимущественно синим.

Несмотря на частичное спектральное перекрытие полосы чувствительности синего (B) канала КМОП-матрицы и спектра флуоресценции рибофлавина, регистрируемый отклик в B-канале остается пренебрежимо малым. Это обусловлено тем, что основная энергия флуоресцентного излучения сконцентрирована в области максимума (~520–530 нм), что приводит к насыщению зелёного (G) канала. Интенсивность излучения на коротковолновом склоне спектра, перекрывающемся с зоной чувствительности B-канала, снижается на 2–3 порядка и не превышает уровень собственного шума матрицы, что исключает его вклад в дальнейшие расчёты. Это позволяет проводить количественное сравнение интенсивностей флуоресценции с высокой достоверностью и минимизировать артефакты, обусловленные спектральным перекрытием каналов. Таким образом, достигается аппаратная спектральная дифференциация, встроенная в конструкцию сенсора.

Такое спектральное разделение аналитических сигналов от оксилипинов и рибофлавина B- и G-каналами матрицы смартфона создаёт условия для корректной интерпретации интенсивностей сигналов при определении относительной концентрации оксилипинов.

Ратиометрический RGB-анализ флуоресценции молочных продуктов

Для количественной оценки соотношения сигналов оксилипинов и рибофлавина использован показатель B/G, где B и G — средние значения интенсивности в синем и зелёном каналах матрицы смартфона. Канал B регистрирует аналитический сигнал (флуоресценция оксилипинов), канал G служит внутренним референсным сигналом (флуоресценция рибофлавина). Оксилипиновое число (далее — ОЧ), рассчитываемое как отношение B/G, является безразмерной величиной, позволяющей оценивать степень окислительной порчи сливочного масла, обусловленной как накоплением эндогенных оксилипинов при хранении, так и внесением экзогенных оксилипинов при фальсификации растительными маслами.

Использование ратиометрического подхода (отношение интенсивностей B- и G-каналов) направлено на усиление аналитического отклика за счёт дифференцированной динамики сигналов флуорофоров. При фальсификации сливочного масла растительными жирами интенсивность флуоресценции оксилипинов (B-канал, 440–485 нм) возрастает в несколько раз вследствие высокого содержания ПНЖК в растительных маслах. Интенсивность флуоресценции рибофлавина (G-канал, 520–530 нм) остаётся относительно стабильной, поскольку рибофлавин водорастворим и сохраняется в молочной плазме при сепарации молочного жира и повторной эмульгации растительных жиров.

Математическое преимущество ратиометрии:

При увеличении доли фальсификата отношение B/G изменяется преимущественно за счёт роста интенсивности B-канала:

B/G = (B₀ + ΔB) / G₀,

где B₀ и G₀ — базовые интенсивности для натурального масла, ΔB — значительное приращение сигнала оксилипинов.

Это приводит к нелинейному усилению аналитического сигнала: даже при умеренных уровнях фальсификации (5–15 %) индекс B/G демонстрирует существенное относительное изменение, что повышает чувствительность метода по сравнению с одноканальными измерениями. Дополнительно ратиометрический подход компенсирует общие вариации интенсивности, связанные с нестабильностью источника возбуждения, геометрией измерения и оптическими свойствами образца.

С целью выявления оптимальной интенсивности излучения активирующего флуоресценцию флуорофоров в молочных продуктах для измерений содержания оксилипинов был использован способ бокового освещения образца с последующей обработкой снимка градиентной флуоресценции и изменения ОЧ  в зависимость от интенсивности УФ 365 нм.

Была разработана  конструкция мини-люминоскопа  обеспечивающая возбуждение флуоресценции одним излучающим УФ светодиодом расположенным под углом 95 градусов на периферийной области образца.

Рисунок 7. Схема экспериментального мини-люминоскопа использованного для регистрации флуоресценции образцов: 1 - камера смартфона, 2 - длинноволновый, УФ отсекающий фильтр, 3 - УФ светодиод с фильтром  из стекла Вуда, 4 - полипропиленовая ёмкость для исследуемых образцов, 5 исследуемый образец

На рис. 7 показана схема экспериментального минилюминоскопа в котором был использован в качестве источника УФ излучения 365 нм светодиод с максимальной силой света Iv макс., 400 мКд, видимым телесным углом 30 градусов.

Рисунок 8. Экспериментальный мини-люминоскоп: 1 – разъём питания Type-C, 2 - УФ светодиод с фильтром  из стекла Вуда, 3 – полипропиленовая ёмкость с исследуемым образцом, 4 – флуоресценция маргарина в смотровом окне мини-люминоскопа. А – фотография градиента флуоресценции маргарина, Б – фотография градиента флуоресценции сливочного масла

На рис. 8 показана регистрируемая градиентная флуоресценция маргарина (А) и сливочного масла (Б).

Регистрацию флуоресценции образцов осуществляли в мини-люминоскопе (схема представлена на рис. 7) с использованием смартфона Redmi 10C и приложения Camera FV-5 Lite (версия 5.3.7) при фиксированных настройках: баланс белого — «дневной свет», выдержка — 1/11 с, ISO 4000.

Для обработки массива экспериментальных данных был разработан специализированный «Программный модуль пакетного анализа спектральных профилей флуоресценции на основе RGB-декомпозиции цифровых изображений», реализованный в виде кроссплатформенного веб-приложения. Программа предназначена для автоматизированного пакетного анализа серий цифровых изображений флуоресцирующих образцов.

Ключевые функции алгоритма включают:

Пространственную деконволюцию изображения: Автоматическое считывание файлов и разложение растрового изображения на индивидуальные цветовые каналы (Red, Green, Blue) с применением адаптивного масштабирования и прореживания пиксельной сетки для оптимизации вычислительной нагрузки.

Спектральную бининг-сортировку: Группировка пикселей в 256 дискретных интервалов (бинов) в соответствии с интенсивностью сигнала в синем канале (G = 0–255), что позволяет использовать значение G как квази-спектральную координату.

Статистическую фильтрацию шумов: Для каждого бина интенсивности рассчитывается медианное значение отношения сигналов синего и зеленого каналов (B/G), что обеспечивает высокую робастность метода к выбросам, шуму матрицы и неравномерности освещения, в отличие от использования среднего арифметического.

Реконструкцию спектрального профиля: Формирование итоговой таблицы зависимостей Median(B/G) = f(G) для каждого образца в серии, экспорт данных в табличные процессоры и визуализация многоканальных спектральных профилей для сравнительного анализа.

Использование данного инструмента позволило существенно сократить время обработки данных и исключить субъективную ошибку оператора при ручном снятии показаний с графиков.

Для оценки спектральной селективности каналов G и B байеровской матрицы смартфона с использованием разработанного программного обеспечения проанализированы цифровые изображения градиентных спектров отражения от поверхности, покрытой полуглянцевыми акриловыми титановыми белилами. Измерения выполнены при монохроматическом освещении светодиодами с длинами волн 450, 475, 502 и 520 нм, а также при регистрации флуоресценции молока «Пармалат» (жирность 0,05 %).

Рисунок 9. Зависимости отклика зелёного канала (G) от интенсивности сигнала синего канала (B) байеровской матрицы смартфона при различных типах возбуждения: 1 — светодиод 450 нм, 2 — светодиод 475 нм, 3 — светодиод 502 нм, 4 — светодиод 520 нм, 5 — флуоресценция флуоресценции молока «Пармалат» (жирность 0,05 %) (λ возб = 365 нм). Образец для кривых 1–4: градиент отражения от поверхности, покрытой полуглянцевыми акриловыми титановыми белилами

На основании анализа зависимостей отклика зелёного канала (G) от интенсивности сигнала синего канала (B) при монохроматическом освещении (450, 475, 502 и 520 нм) и регистрации флуоресценции рибофлавина в молоке «Пармалат» (жирность 0,05 %), показанных на рис. 9, экспериментально подтверждена высокая спектральная селективность байеровской матрицы смартфона. Показано, что в синей области спектра (450–475 нм) перекрёстная чувствительность зелёного канала не превышает 8–9 единиц при уровне сигнала B = 50 (G/B < 0,2), что исключает существенные спектральные помехи при детектировании оксилипинов. В переходной области (502 нм) наблюдается плавный рост отклика с коэффициентом передачи G/B ≈ 2,2, тогда как при 520 нм и в случае флуоресценции рибофлавина насыщение зелёного канала достигается уже при низких значениях сигнала в синем канале. Данные зависимости подтверждают корректность использования отношения B/G в качестве селективного аналитического сигнала.

Установлено, что длина волны 502 нм соответствует спектральному порогу качественного изменения механизма регистрации флуоресценции окисленных липидов. В данной области происходит критическое перекрытие спектра излучения вторичных оксилипинов (альдегидов и кетонов с конъюгированными π-системами) с полосой пропускания зелёного фильтра байеровской матрицы. Накопление указанных продуктов окисления вызывает красный сдвиг флуоресценции, рост отклика зелёного канала и, как следствие, снижение отношения B/G (ОЧ). Это регистрируется как визуальный эффект «белесости». Коэффициент передачи сигнала при 502 нм (k ≈ 2,0) на порядок превышает аналогичный параметр для диапазона 450–475 нм (k < 0,1), что подтверждает переходный характер данной спектральной зоны и обосновывает её применение в качестве индикатора степени окисления в экспресс-методах контроля качества липидов.

Строгое соблюдение протокола отбора проб сливочного масла является необходимым условием обеспечения достоверности и воспроизводимости флуоресцентных измерений. Отбор проб должен осуществляться после удаления поверхностного слоя образца, поскольку воздействие света и кислорода вызывает как деградацию рибофлавина, так и приповерхностную окислительную порчу жировой фазы.

Поверхность образцов сливочного масла (особенно 72,5%) должна быть свободной от капель молочной плазмы и конденсационной влаги, образующихся при размораживании. Поскольку метод регистрирует приповерхностную флуоресценцию, повышенное содержание рибофлавина в таких каплях может систематически занижать измеряемое ОЧ.

Рисунок 10. Графики зависимости ОЧ от интенсивности G канала (интенсивности активирующего флуоресценцию УФ излучения):  1 — маргарин «Хозяюшка» (жирность 72,5 %, АО «Нижегородский МЖК», г. Нижний Новгород), 2 — масло сливочное «Milky Time» (жирность 72,5 %, ООО «Амстердам», г. Курск), 3 — масло традиционное «Деревенская бурёнка» (жирность 82,5 %, ООО «Лав Продукт», Московская обл.), 4 – масло сливочное традиционное «Вкуснотеево» (жирность 82,5 %, ПАО МК «Воронежский»), 5 — масло сливочное «Традиционное» (жирность 82,5 %, ООО «Ливенский маслозавод», Орловская обл.), 6 - Масло сладкосливочное «Вологодское», (жирность 82,5 %, ООО "Маслозавод Тотемский")

На Рис. 10 показаны Графики зависимости ОЧ от интенсивности G канала типичных продуктов масложировых продуктов, представленных в российской розничной торговле. Из этих зависимостей видно, что есть по крайней мере три области интенсивностей возбуждающего флуоресценцию УФ излучения, вызывающие отличия по динамике нарастания или падения ОЧ. Первая, при величине G до 50, не вошла в график в связи со значительными вариациями шума и нестабильности. Вторая, при G до 100 имеет значительное изменение B/G. Третья, при G от 100 до 200 имеет пологие зависимости с разным углом наклонения. Четвертая, при G более 200, характеризуется резкими изменениями зависимостей B/G.

Для уточнения области оптимальных значений величины G для вычислений ОЧ необходимо провести измерения образцов с калиброванными, известными значениями относительных содержаний оксилипинов. Пробоподготовка калибровочных смесей из пастообразных компонентов требует длительного перемешивания и нет гарантии, что часть смеси имеет гомогенизированную структуру. Поэтому для измерений были использованы жидкие продукты – цельное молоко и топлёное молоко в качестве источника большого количества молочных оксилипинов.

Рисунок 11. Графики зависимости ОЧ (B/G) от цифрового отклика зеленого канала камеры (G)

1 — топлёное молоко "Авида" (жирность 3,2 %, ЗАО Молочный комбинат "Авида"), 2 — 90% топлёное молоко / 10 % цельное молоко, 3 — 80% топлёное молоко / 20 % цельное молоко, 4 — 70% топлёное молоко / 30 % цельное молоко, 5 — 60% топлёное молоко / 40 % цельное молоко, 6 — 50% топлёное молоко / 50 % цельное молоко, 7 — 40% топлёное молоко / 60 % цельное молоко, 8 — 30% топлёное молоко / 70 % цельное молоко, 9 — 20% топлёное молоко / 80 % цельное молоко, 10 — 10% топлёное молоко / 90 % цельное молоко, 11 — молоко цельное питьевое пастеризованное "ВкусВилл" (жирность 3,4 %, АО "Молочный комбинат "Пензенский")

Представленные на рис. 11 профили демонстрируют выраженную корреляцию формы кривой с массовой долей топлёного молока в пробе. Все 11 экспериментальных зависимостей (соответствующих содержанию топлёного компонента от 0% до 100%) имеют четкое пространственное разделение. Наблюдается монотонный рост величины ОЧ (B/G) при увеличении концентрации продуктов термоокисления.

Анализ профилей позволил выделить четыре характерных участка зависимости:

• Область низких сигналов (G < 50): Зона доминирования электронного шума матрицы, характеризующаяся высокой дисперсией отношения B/G. Данный участок исключен из анализа как неинформативный.

• Переходная зона (G = 50–95): Участок резкого нелинейного изменения коэффициента B/G, особенно при высоких концентрациях оксилипинов. Ввиду сильной нелинейности отклика, эта область также не используется для количественных расчетов.

• Рабочая линейная область (G = 95–140): Интервал, в котором наблюдается наиболее стабильная и линейная зависимость между параметрами. Именно в этом диапазоне достигается максимальная сепарация кривых для различных концентраций и минимизируется перекрытие доверительных интервалов, что обеспечивает наивысшую чувствительность метода.

• Зона насыщения (G > 140): Область, где происходит искривление профилей вследствие выхода сигнала на плато (насыщение фотоприемника) и снижения относительного вклада оксилипинов при их низких концентрациях.

На основании полученных данных в качестве рабочего диапазона для расчета интегрального оксилипинового индекса был выбран интервал интенсивности зеленого канала G = 95–140, обеспечивающий оптимальное соотношение сигнал/шум и линейность отклика и разработано специализированное кроссплатформенное веб-приложение «Оксилипиновое Число» для экспресс-оценки качества молочных продуктов на основе анализа флуоресцентных изображений. Веб-приложение позволяет пакетно обрабатывать серии фотографий (5–10 кадров), сделанных камерой смартфона в режиме ручной настройки фиксированного баланса белого. По результатам серии измерений веб-приложение вычисляет:

• Среднее значение ОЧ (интегральный показатель качества);

• Стандартное отклонение (SD) — абсолютную меру разброса данных;

• Коэффициент вариации (CV) — относительную меру прецизионности метода. На основе CV формируется автоматический вердикт о достоверности измерения («Лабораторная точность», «Хорошая повторяемость» или рекомендация повторить серию).

Встроенный модуль визуализации сопоставляет полученное значение пользователя с эталонной шкалой, включающей реперные точки для натурального сливочного масла, допустимых сезонных колебаний, спредов и маргаринов. Результат отображается в ранжированном списке с цветовой индикацией качества продукта.

Преимущества подхода: Использование медианной статистики и пакетной обработки серии кадров позволяет нивелировать влияние случайных шумов и нестабильности освещения, достигая воспроизводимости результатов, сопоставимой с лабораторными методами анализа.

Фактура поверхности образца: Варьирование микрорельефа поверхности среза сливочного масла (гладкий срез ножом, неровная поверхность, наличие воздушных пор) не приводит к выходу значений за пределы допустимой погрешности метода. Локальные неоднородности эффективно усредняются при пакетной обработке серии изображений и расчете медианного значения по большому ансамблю пикселей, что делает его пригодным для использования в качестве инструмента входного контроля качества вне специализированных лабораторий.

Оценку чувствительности метода для анализа сливочного масла проводили путём измерения ОЧ модельных смесей, имитирующих различные степени фальсификации сливочного масла маргарином. Калибровочные образцы с массовой долей маргарина 10, 20, 30 и 40% (мас./мас.) изготавливали в трёх аналитических повторностях. Регистрацию флуоресценции каждого образца осуществляли в трёх технических повторностях.

В качестве исходного сырья использованы:

• сливочное масло «Крестьянское» (массовая доля жира 72,5%, ГОСТ 32261-2013, производитель: АО «Болховский сыродельный завод», Орловская область);

• маргарин МТ «Добавкин Домашний Евдаковский» (массовая доля жира 60%, ГОСТ 32188-2013, производитель: ООО «Евдаково», Воронежская область). Состав маргарина: рафинированные дезодорированные растительные масла (натуральные и модифицированные).

Гомогенизацию навесок сливочного масла и маргарина проводили в полипропиленовых ёмкостях с помощью пластиковой мешалки при комнатной температуре в течение 5 минут.

Рисунок 12. Калибровочная зависимость ОЧ от массовой доли маргарина в модельных смесях со сливочным маслом. Точки — средние значения (n=9)

Калибровочная зависимость ОЧ от массовой доли маргарина  (см. рис. 12) в диапазоне 0–40% описывается линейным уравнением y = 0,805 + 0,0113x с коэффициентом детерминации R² = 0,993. Предел обнаружения (LOD), рассчитанный как 3,3×Sy/x/b, составляет 2,6%, предел количественного определения (LOQ) — 7,9%. Стандартная ошибка оценки Sy/x = 0,0089 и коэффициент вариации в диапазоне 0,4–1,6% подтверждают высокую воспроизводимость метода. Полученные метрологические характеристики свидетельствуют о пригодности разработанного метода для количественной оценки фальсификации сливочного масла растительными жирами в концентрации свыше 8%.

Параметры калибровочной зависимости (y = a + bx) зависят от исходного ОЧ масла: свободный член a определяет вертикальное смещение кривой, а угловой коэффициент b — её наклон. Для свежего масла «Вологодское» (ОЧ = 0,638) начальный участок графика будет круче, чем для исследованного образца (ОЧ = 0,760), вследствие большего относительного прироста сигнала при добавлении фальсификата (49% против 25% при 10% маргарина). Это требует индивидуальной калибровки для точного количественного анализа. Однако, поскольку экономически мотивированная фальсификация обычно предполагает замену ≥30% молочного жира, для качественного выявления фальсификата высокая точность в области низких концентраций не критична. Кроме того, в связи с тем, что в качестве заменителя могут использоваться сильно окисленные (прогоркшие) растительные масла, ОЧ может дополнительно снижаться. Это происходит за счет появления в спектре флуоресценции таких фальсификатов вторичных и третичных продуктов окисления с длинноволновыми максимумами излучения, что приводит к эффекту «белесости» и падению отношения B/G. Например, ОЧ пальмового масла после экспозиции на воздухе в течение нескольких дней при 20 °C снижается с 1,54 до 1,21.

В ходе валидации метода установлено, что фиксация баланса белого существенно повышает межприборную воспроизводимость результатов на различных моделях смартфонов. Однако применение производителями разных алгоритмов постобработки сигнала, а также возможных различий спектральных характеристик используемых матриц приводят к возникновению систематических погрешностей при измерениях ОЧ. Это вызывает смещение рассчитанного ОЧ относительно референтных значений, полученных в настоящем исследовании. Дополнительным ограничением является отсутствие в интерфейсе некоторых устройств возможности точной ручной фиксации баланса белого в профессиональном режиме съёмки.

Последняя проблема решена методом аппаратно-программной коррекции баланса белого на основе встроенного референсного градиента.

Рисунок 13. А.  Схема экспериментального мини-люминоскопа использованного для регистрации флуоресценции: 1 - камера смартфона, 2 -  длинноволновый, УФ отсекающий фильтр, 3 - УФ светодиод (365 нм) с фильтром  из стекла Вуда в области флуоресценции исследуемого образца, 4 - ёмкость для исследуемых образцов, 5 - исследуемый образец, 6 – блок с линейным градиентом освещённости белым светом (5000 K) в опорной зоне. Б. Фотография экспериментального мини-люминоскопа. В. Фотография области флуоресценции образца и эталонной шкалы яркости

Конструкция мини-люминоскопа, представленная на рис. 13, обеспечивает одновременную регистрацию в кадре двух зон: области флуоресценции исследуемого образца (3) и эталонной шкалы с линейным градиентом яркости белого света (6). При использовании автоматического баланса белого камера смартфона идентифицирует область (6) как эталон нейтрального серого, что позволяет стабилизировать цветовую температуру кадра при измерении отношения каналов B/G в зоне флуоресценции.

Программная реализация и мобильное веб-приложение

Рисунок 14. Графический пользовательский интерфейс мобильного измерительного веб-приложения «Оксилипиновое Число — Камера»:
1 — поле отображения вычисленного значения ОЧ, 2 — зона видеопотока с направляющей рамкой калибровки по эталонной шкале яркости, 3 — зона видеопотока с направляющей рамкой регистрации флуоресценции исследуемого образца, 4 — кнопки управления измерением; 5 — интерактивная шкала интерпретации результата.
Примечание: окна измерения и сравнительной шкалы совмещены в едином интерфейсе для компактности представления

На рис. 14. Показан графический интерфейс мобильного веб-приложения для экспресс-определения ОЧ сливочного масла по флуоресценции с помощью камеры смартфона. После позиционирования образца в мини-люминоскопе (совмещение калибровочной и измерительной зон с рамками на экране) нажатие кнопки «Измерить» запускает расчёт отношения интенсивностей каналов B/G с отображением результата на экране. Кнопка «Сравнить» открывает модальное окно с цветовой шкалой и реперными точками для качественной интерпретации полученного значения.

Наличие в кадре референсной зоны с известной цветовой температурой (5000 К), идентифицируемой алгоритмами автоматического баланса белого камеры смартфона как нейтральный серый эталон, позволяет стабилизировать цветовую температуру съёмки в постоянном диапазоне, существенно компенсируя спектральные различия матриц смартфонов.

Визуальные направляющие окна «Калибровка» служат ориентиром для правильного позиционирования образца в поле зрения камеры. Расчёт аналитического сигнала (ОЧ) производится исключительно в зоне флуоресценции образца по алгоритму, описанному ранее.

Преимуществом мобильного веб-приложения является кроссплатформенность (работа в любом современном браузере), отсутствие необходимости установки ПО, и ручной настройки параметров камеры.

Межприборная воспроизводимость метода

С целью выявления межприборной воспроизводимости были проведены замеры 5 образцов с разными ОЧ двумя моделями смартфонов в 50 повторностях на каждый образец.

Рисунок 15. Сравнение значений оксилипинового числа, полученных двумя моделями смартфонов (Galaxy J1 mini и Redmi 10C), для пяти образцов молочных и масложировых продуктов: 1 — масло сливочное «Крестьянское» 72,5% (ЗАО «Болховский сыродельный завод»), 2 — сливки питьевые ультрапастеризованные «Домик в деревне» 20% (АО «Вимм-Билль-Данн»), 3 — пальмоядровое масло рафинированное прогоркшее (Индонезия), 4 — спред растительно-жировой «Кремлёвское» 60% (АО «Нижегородский масло-жировой комбинат»), 5 — масло сладкосливочное «Milky Time» 72,5% (ООО «Амстердам»)

На рис. 15 показаны сравнительные измерения пяти образцов двумя смартфонами (Galaxy J1 mini, Redmi 10C) показали высокую внутриприборную воспроизводимость (IQR < 0,006), однако выявили нелинейное межприборное смещение: от +12% при низких значениях ОЧ (~0,56) до –0,3% при средних (~1,22) и +0,6% при высоких (~1,24). Такая зависимость обусловлена различиями в спектральной чувствительности матриц и алгоритмах обработки сигнала (ISP). Следовательно, компенсация межприборных различий требует не аддитивной поправки, а многоточечной регрессионной калибровки (≥3 референсных образца в диапазоне 0,5–1,3) или нормировки по встроенным аппаратным якорям.

Рисунок 16. Медианные значения ОЧ для одного образца сливочного масла («Крестьянское» 72,5%, ОАО «Рогачевский МКК»), измеренные четырьмя моделями смартфонов (n=50):      1 — RMX3363, 2 — RMX3740,  3 — HONOR X8b, 4 — Redmi 10C. Красным выделена модель, использованная в качестве референсной в предыдущих экспериментах

На рис. 16 представлены медианные значения ОЧ, полученные при измерении одного образца сливочного масла четырьмя моделями смартфонов (n=50). Красным маркером выделены данные смартфона Redmi 10C, который использовался в качестве референсного устройства во всех предыдущих экспериментах.

Межприборное сравнение показало высокую внутриприборную воспроизводимость: коэффициент вариации (CV) составил 0,3–0,5% для трёх из четырёх моделей. Однако систематическое смещение между устройствами достигало 27% относительно минимального значения (диапазон медиан: 0,690–0,880).

Полученные данные подтверждают необходимость индивидуальной калибровки для каждой модели смартфона или использования относительных метрик, нормированных по встроенным референсным источникам.

Рисунок 17. Статистическое распределение значений ОЧ при межприборном сравнении (box-plot, n=50 измерений на устройство)

Анализ распределения значений ОЧ (Рис. 17) показал высокую внутриприборную повторяемость измерений: межквартильный размах (IQR) не превышал 0,005 для трёх из четырёх моделей смартфонов, а коэффициент вариации составил 0,3–0,5%. Исключение составил HONOR X8b (CV = 4,6%), что может быть связано с особенностями алгоритмов автоматической обработки изображения данной модели. Малый случайный разброс измерений внутри каждого устройства означает, что систематическое смещение между смартфонами (до 27%, диапазон медиан 0,690–0,880) имеет воспроизводимый характер и может быть скомпенсировано путём индивидуальной калибровки. Таким образом, после определения поправочных коэффициентов любая из протестированных моделей смартфонов пригодна для реализации предложенного метода с целью надёжного выявления фальсифицированного сливочного масла.

Практическая апробация метода

Предложенным методом исследованы типичные молочные и масложировые продукты, представленные в российской розничной сети. Результаты измерений ОЧ представлены в таблицах 1–4.

Таблица 1.

Значения оксилипинового числа в образцах сливочного масла различных производителей

В табл. 1 представлены результаты измерения ОЧ для образцов сливочного масла различных производителей. Пять образцов со значениями ОЧ в диапазоне 0,638–0,845 идентифицированы как аутентичные продукты, изготовленные из натуральных сливок с соблюдением технологических регламентов и условий хранения. Данные значения отражают приемлемую степень окисления липидной фазы, характерную для качественного сливочного масла. Два образца с аномально высокими значениями ОЧ (1,439 и 1,526) по данному параметру сопоставимы с маргаринами и спредами табл. 2, что указывает на наличие признаков фальсификации растительными жирами и/или глубокой окислительной порчи. Наблюдается чёткое разделение групп продуктов: разница между максимальным значением для аутентичных образцов и минимальным для подозрительных превышает 70%. Это позволяет использовать пороговое значение ОЧ ≈ 1,2 для экспресс-выявления фальсифицированного или испорченного сливочного масла в розничной сети.

Таблица 2.

Значения оксилипинового числа в образцах спредов и маргаринов

Из данных измерений в табл. 2 можно сделать вывод, что все образцы комбинированных жировых продуктов демонстрируют стабильно высокие значения ОЧ (1,4–1,6), что согласуется с ожидаемым содержанием окисленных растительных жиров заявленных в составе этих продуктов. Это подтверждает дискриминирующую способность метода для идентификации молочных продуктов и спредов, фальсификатов и маргаринов.

Таблица 3.

Влияние термической обработки на оксилипиновое число молочных продуктов

Из табл. 3 видно, что пастеризованное молоко демонстрирует низкие значения ОЧ (0,45–0,67), что отражает высокую сохранность липидов в связи не большим сроком их контакта с кислородом воздуха. Топлёное молоко демонстрирует аномально высокое ОЧ (1,508), что объясняется длительной термической обработкой, ускоряющей окисление ненасыщенных жирных кислот. Это подчёркивает необходимость учёта технологии переработки молочных продуктов при интерпретации результатов.

Таблица 4.

Значения оксилипинового числа в образцах питьевых сливок различных производителей

Из табл. 4 видно, что сливки демонстрируют промежуточные значения ОЧ (0,66–0,96) между молоком и маслом, что согласуется с их составом (20% жира). Большая величина ОЧ у сливок «Домик в деревне» может свидетельствовать о их большом сроке и не соблюдённых условиях хранения.

При интерпретации результатов следует учитывать, что исследуемые образцы каждой торговой марки представляли собой отдельные производственные партии, выпущенные в разные календарные периоды. Вариабельность исходного сырья, обусловленная сезонными изменениями в рационе животных (переход от пастбищного к стойловому кормлению), а также различия в рецептурах и технологических допусках конкретных партий комбинированных жировых продуктов, закономерно приводит к разбросу значений ОЧ. Наблюдаемые отклонения в показаниях для одноимённых продуктов (включая спреды и маргарины) являются ожидаемыми и отражают реальную гетерогенность коммерческой продукции, а не погрешность измерительного метода.

Ограничения метода

К ограничениям разработанного метода относятся:

• Невозможность выявления фальсификации животными жирами. Метод не детектирует замену молочного жира на животные жиры (говяжий, свиной и др.), поскольку они не содержат повышенных концентраций оксилипинов, характерных для растительных масел с высоким содержанием ПНЖК.

• Применение метода к определению фальсификации кисломолочных изделий, творога и сыров нуждаются в дополнительных исследованиях, поскольку микробиологические процессы могут изменять профиль флуорофоров и формировать новые флуоресцирующие соединения.

• Анализ образцов с интенсивной собственной окраской, обусловленной пищевыми красителями, какао-порошком и др., невозможен из-за спектрального перекрытия добавок с аналитическими флуоресцентными сигналами оксилипинов и рибофлавина.

• Влияние флуоресцентных гасителей. Присутствие в составе продукта пищевых добавок, обладающих свойствами гасителей флуоресценции рибофлавина, может приводить к ложноотрицательным результатам.

• Необходимость индивидуальной калибровки по категориям продуктов. Каждая категория молочных продуктов требует отдельной калибровки вследствие вариабельности соотношения жировой и водной фаз, что влияет на отношение интенсивностей флуоресценции оксилипинов и рибофлавина.

Выводы

Таким образом, экспериментально подтверждена надёжность метода выявления фальсификации сливочного масла растительными маслами на основе флуоресцентного определения ОЧ. Установлена корреляция отношения интенсивностей каналов B/G камеры смартфона с содержанием оксилипинов в образце и определены пороговые значения аналитического сигнала, обеспечивающие достоверную классификацию продуктов. Полученные данные свидетельствуют о высокой дискриминирующей способности метода и его перспективности для массового экспресс-контроля качества вне лабораторных условий.

Вместе с тем выявлено систематическое межприборное смещение, обусловленное различиями в спектральной чувствительности матриц и алгоритмами автоматической обработки изображения, встроенными в программное обеспечение различных моделей смартфонов. Для масштабирования технологии ключевой задачей последующих исследований станет разработка протокола индивидуальной калибровки, позволяющего автоматически определять и учитывать модель-специфичные поправки при расчёте ОЧ. Это обеспечит межприборную воспроизводимость результатов и сделает метод универсальным инструментом контроля для любого современного смартфона.