ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ ДИСБАЛАНС, ИНДУЦИРОВАННЫЙ УФ-ИЗЛУЧЕНИЕМ И НЕКОГЕРЕНТНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ, В ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТКАХ

Аннотация. Клеточный окислительно-восстановительный баланс имеет важное значение для функционирования иммунной системы. Клетки иммунной системы, благодаря продукции активных форм кислорода в процессе интернализации частиц, особенно чувствительны к экзогенным факторам, изменяющим их окислительный баланс. Ультрафиолетовое излучение и некогерентное излучение вызывают окислительный стресс, однако механизмы их воздействия на окислительно-восстановительный метаболизм систематически не сравнивались. В данном исследовании мы изучили влияние обоих типов излучения (1, 5 и 15 Дж/м²) на окислительно-восстановительный статус клеток, оценивая соотношение НАДН/ФАД (митохондриальный индикатор) и соотношение НАДН/НАД (цитозольный индикатор) с помощью спектрофлуориметрии. Результаты выявили различные профили окислительно-восстановительного дисбаланса. УФ-излучение в дозе 15 Дж/м² вызывало окислительно-восстановительный коллапс (снижение НАДН/ФАД в 21 раз за 1 минуту и НАДН/НАД в 5 раз за 60 минут, (p < 0,001)), тогда как некогерентное излучение в той же дозе приводит лишь к отсроченному и умеренному снижению НАДН/ФАД без изменения НАДН/НАД. Таким образом, уф-излучение индуцирует глобальный и необратимый окислительный стресс за счет прямого фотохимического повреждения, в то время как некогерентное излучение оказывает более мягкое и преимущественно митохондриальное воздействие, что открывает перспективы его использования для контролируемой иммуномодуляции.

Ключевые слова: НАДН/ФАД; НАДН/НАД; УФ-излучение; некогерентное излучение; мононуклеарные клетки; окислительно-восстановительный метаболизм.

Клеточный окислительно-восстановительный баланс имеет фундаментальное значение для гомеостаза и правильного развития иммунного ответа. Клетки иммунной системы, в частности мононуклеарные клетки периферической крови — включающие моноциты и лимфоциты — активно участвуют в регуляции иммунных реакций. Моноциты, являющиеся основными фагоцитирующими клетками в крови, генерируют активные формы кислорода в рамках своего защитного механизма во время интернализации частиц [1, c. 427–454]. Однако, когда этот баланс нарушается экзогенными факторами, такими как радиация, возникающий окислительный стресс может поставить под угрозу жизнеспособность и функцию клеток.

Ультрафиолетовое (УФ) излучение и некогерентное излучение — это два типа физического излучения, которому подвергаются организмы в окружающей среде, на рабочем месте и в клинических условиях. Хотя оба типа излучения, как известно, вызывают клеточный стресс, механизмы их действия на окислительно-восстановительный метаболизм принципиально различны [2, c. 8242]. УФ-излучение действует посредством прямого фотохимического повреждения биомолекул, в то время как некогерентное излучение вызывает окислительный стресс в основном за счет вторичных активных форм кислорода [3, c. 1936–1945; 4, c. 14-29].

Коферменты НАД, НАДН и ФАД являются ключевыми индикаторами клеточного окислительно-восстановительного и метаболического статуса. Соотношение НАДН/ФАД отражает митохондриальный окислительно-восстановительный баланс, тогда как соотношение НАДН/ НАД указывает на цитозольный окислительно-восстановительный баланс. Изменения этих соотношений могут указывать на изменения в производстве АТФ, энергетическом метаболизме и способности реагировать на окислительный стресс [5, c. 875-889]. Таким образом, данное исследование позволяет нам понять иммуномодулирующее действие радиации и ее потенциальное использование в терапевтических целях.

Целью данного исследования является оценка окислительно-восстановительного дисбаланса, вызванного УФ-излучением и некогерентным излучением в мононуклеарных клетках

Материалы и методы

Исследование проводилось исключительно на мононуклеарных клетках выделены из здоровых крыс в возрасте от 6 до 10 месяцев методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием фиколла. После выделения клетки ресуспендировали в физиологическом растворе до достижения рабочей концентрации клеток 2,5 ± 1 x 10⁶ клеток/мл.

Фагоцитоз индуцировали инкубацией с латексными частицами (концентрация 0,01 г/мл). Затем клетки подвергали воздействию двух типов излучения: ультрафиолетового (УФ) и некогерентного излучения, генерируемого искровым разрядом. В качестве источника некогерентного излучения использовалась экспериментальная установка «ИК-50» (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва). Некогерентное импульсное излучение генерировалось искровым разрядом в воздухе с частотой ~50 Гц и спектром излучения от 200 до 800 нм. Применяли три дозы излучения: 1, 5 и 15 Дж/м². Облучение проводили на клеточных суспензиях в физиологическом растворе, измерения проводили сразу после облучения (время 0) и через 60 минут после облучения.

Клеточный окислительно-восстановительный баланс оценивали путем измерения флуоресценции коферментов НАДН (возбуждение: 350 нм, эмиссия: 450 нм) и ФАД (возбуждение: 450 нм, эмиссия: 510 нм), а спектров поглощения метаболических коферментов: НАД (λ = 260 нм)  и НАДН (λ = 360 нм).

Соотношение НАДН/ФАД (индикатор митохондриального окислительно-восстановительного состояния) и соотношение НАДН/НАД (индикатор цитозольного окислительно-восстановительного баланса) рассчитывались на основе измеренных интенсивностей флуоресценции.

Данные анализировались с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки. Значимость: p <0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ соотношений НАДН/ФАД и НАДН/НАД выявил существенно различающиеся профили окислительно-восстановительного дисбаланса при УФ-облучении и некогерентном излучении (рис.1).

Рисунок 1. Коэффициент отношении между (а) флуоресценцией НАДН/ФАД и (б) спектром поглощения НАДН/НАД мононуклеарных клеток после воздействия некогерентного излучения (ир) и УФ-излучением (уф) в разных дозах (Дж/м²) через 1 и 60 минут после начала фагоцитоза

* – различия статистически значимы по сравнению с контролем (р <0,05).

# – различия статистически значимы по сравнению с минутой 1 в соответствующей группе (р <0,05)

При УФ-облучении наблюдалось значительное дозозависимое снижение соотношения НАДН/ФАД, достигающее резкого 21-кратного падения всего за 1 минуту после облучения при дозе 15 Дж/м² (p < 0,001), что указывает на митохондриальный окислительно-восстановительный коллапс, соответствующий прямой фотодеградации коферментов. Этот эффект сохранялся в течение 60 минут, подтверждая серьезность повреждения. В отличие от этого, некогерентное излучение в той же дозе (15 Дж/м²) вызывало значительное, но гораздо более мягкое и отсроченное снижение соотношения НАДН/ФАД, которое достигло статистической значимости только через 60 минут (p <0,05), отражая постепенный митохондриальный окислительный стресс, вероятно, опосредованный косвенно образующимися вторичными реактивными видами. При дозах 1 и 5 Дж/м² ни один из типов излучения не вызывал значительных изменений в соотношении НАДН/ФАД (p> 0,05), что позволяет предположить, что пороговое значение для обнаружения изменений митохондриального окислительно-восстановительного баланса достигается при более высоких дозах или более длительном времени облучения [6, c. 1066; 7, c. 13-26].

Что касается соотношения НАДН/НАД, отражающего цитозольный окислительно-восстановительный баланс, результаты были столь же противоречивыми: УФ-излучение при дозе 15 Дж/м² вызывало пятикратное снижение этого соотношения через 60 минут (p < 0,001), демонстрируя серьезный окислительно-восстановительный дисбаланс в цитозоле, в то время как некогерентное излучение, даже при самой высокой дозе, не вызывало значительных изменений в соотношении НАДН/НАД(p > 0,05), что указывает на относительное сохранение цитозольного окислительно-восстановительного баланса. При средних дозах УФ-излучения (5 Дж/м²) через 60 минут было обнаружено умеренное снижение соотношения НАДН/НАД (p <0,05), что указывает на усиление окислительного стресса, предшествующее коллапсу, наблюдаемому при 15 Дж/м² [7, c. 13-26].

Полученные результаты демонстрируют, что УФ-излучение в изученных дозах вызывает глобальный окислительно-восстановительный коллапс в мононуклеарных клетках, который затрагивает как митохондриальный, так и цитозольный компартменты клетки.  Процесс имеет сверхбыструю кинетику, соответствующую прямому фотохимическому повреждению УФ-излучением клеточных и молекулярных структур. Некогерентное излучение вызывает более мягкое, преимущественно митохондриальное, метаболическое нарушение с замедленной кинетикой, отражающее косвенный механизм повреждения, опосредованный вторичными реактивными метаболитами.