Получение комплексного белка состоящий из диагностических Omp антигенов бруцелл

Аннотация. В статье рассматриваются препятствующих внедрению ИФА-теста на основе Omp. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в Республике Казахстан совместными усилиями научного потенциала и практической ветеринарной деятельности, проблема ликвидации бруцеллеза животных не решена. Устойчивый высокий уровень заболеваемости людей бруцеллезом и большой социально-экономический ущерб определяют особую значимость этой инфекции в общей структуре инфекционных патологий.

Ключевые слова: Omp (Outer membrane proteins – BMP), Бруцелла, S тип, ДНҚ.

Қазақстан Республикасында ғылыми әлеует пен практикалық ветеринарлық қызметтің бірлескен күш-жігерімен қол жеткізген елеулі жетістіктерге қарамастан, жануарлар бруцеллезін жою мәселесі түпкілікті шешілмеген. Адамдардың бруцеллез ауруымен сырқаттанушылығының тұрақты жоғары деңгейі және үлкен әлеуметтік-экономикалық залал инфекциялық патологиялардың жалпы құрылымында осы инфекцияның ерекше маңыздылығын анықтайды.

Бруцелланың жасушалық мембранасы 3 қабаттан тұрады; ішкі қабаты - цитоплазмалық мембрана, аралық қабат - перифериялық цитоплазмалық мембрана, ал сыртқы қабат - бұл сыртқы мембрана. Сыртқы мембрана жасуша қабырғасында липополисахарид құрайтын пептидогликан қабатымен ақуыз және фосфолипид қабаты тығыз байланысады. Липополисахаридте (LPS) O-тізбегінің болуы немесе болмауы бойынша бруцелланы екі түрге бөлуге болады (S) және кедір-бұдырлы (R). S типті Brucella LPS құрамында O-тізбектері бар, оларда Бруцелла бетіндегі антигендік торлардың көп бөлігі болады; R-типті Brucella LPS-де O-тізбектері жоқ. Сыртқы мембранадағы ақуыз сыртқы мембраналық ақуыздар деп аталады (OMPs). OMP жеткілікті түрде ашыла алмайды, өйткені S-типті Бруцеланың беті LPS-пен қапталған. OMP R-тәрізді Бруцелланың бетінде болуы мүмкін, оның құрамында O-тізбектері жоқ. Бруцелла OMP -лері өте күшті иммуногенетикалықты көрсетеді, бұл Бруцелланың макрофагтарда өмір сүруіне байланысты болуы мүмкін. Бруцелла OMP-дің үш тұқымдасы анықталды: OMP2 тұқымдасы OMP25 / OMP31 тұқымдасы және жоғарыдағы 2 тұқымдасын қоспағанда, барлық OMP-ден тұратын туыстас болып табылады. Алғашқы 2 тұқымдас кеңінен зерттелді және негізінен қорғаныс антиденелері мен бруцелланың вируленттілігіне байланысты антигендерден тұрады. Бруцелланың антигендері T жасушалары арқылы жасалынған макрофагтардың өміршеңдігін тудырады және болдырмайды, осылайша қауіпсіз және тиімді Бруцелла вакциналарын жасауға болады [1] .

Әртүрлі бруцеллалардың арасында B. melitensis адам үшін ең патогенді болып табылады және биоөңдеу санатына енгізілген, ол денедегі тілік, терідегі жаралар және инфекцияланған жануарлармен байланыс арқылы инфекцияны тудыруы мүмкін. Адам бруцеллез диагнозы ауруларды дұрыс емдеу және емдеу үшін өте маңызды,себебі адам қолданатын вакцина жоқ. Бұл зерттеу omp2a (rOmp2a) порин B.melitensis иммунодоминантты ақуызын клондау, экспрессия және тазалау үшін әзірленген.

Сыртқы мембрананың ақуыздары (Outer membrane proteins – BMP)бруцеллалар жаңа вакциналық және диагностикалық препараттарды жасауда шетелдік зерттеушілермен кеңінен қарастырылады. Сыртқы мембрананың ақуыздары бруцеллалардың вируленттілігі мен ерекшелігін анықтайды деп болжанады. Сыртқы мембрананың ақуыздары (OMPU) бруцеллалар өткен ғасырдың 80-ші жылдары зерттеушілердің әртүрлі топтарымен анықталды. Бірінші Ж.Е. Mayfieldetal. (1988) молекулалық массасы 31 кДа (OMP31) бар Бруцеллаабортус ақуыздық антигенін кодтайтын генді оқшаулап, клондап, оны Escherichia coli геномында ендірді. ПТР талдауын жасау үшін OMP31 генінің нуклеотидтер тізбегі қолданылды. Зерттеушілер ELISA [2-4] анти-бруцеллезге қарсы антиденелерді анықтау үшін рекомбинантты аналог OMP31 тиімділігін анықтады. Молекулалық массасы 36 және 33 кДа [5] болатын порин ақуыздарының синтезіне жауап беретін Omp 2L және Omp 2aBrucellaabortus гендерін клондады.

Синтезделген Omp 31 ақуызы мен лумазин синтазасы бар вакцина B. Revis-ке қарсы және B. melitensis-ке қарсы тиімділігі жоғары  болды. Әзірге бұл вакциналар тек зертханалық жануарларға жүргізілген тәжірибелерде жағымды нәтижелер береді[5]. Белок конъюгаттарының полисахаридтерін, соның ішінде B. abortus және porin синтетикалық комплекстерін немесе B. мелитенцисінің O полисахаридтерін ірі қара малдың 51 сарысу альбуминімен, олар короваланың вирустық штамдарынан тышқандарда антиденелер шығаруды және қорғауды тудырды. Төмендегі L7 / L12, SodC, Omp 31, Omp 25 және IalB бруцеллалық антигендерін шығаруға жауапты геннің нуклеотидтік тізбегі бар ДНҚ вакциналары липосомаларға вакциналар енгізілген кезде, тышқандарда жоғары қорғаныс деңгейін тудырды. Осы уақытқа дейін барлық зерттеулер тек зертханалық жануарларға жүргізілді. Тікелей векторлық вакциналар жасау әрекеттері әлі күнге дейін сәтсіз аяқталды. Сонымен қатар, тірі векторлы вакциналарды жаппай профилактикада қолдану ыңғайлы және үнемді, бірақ бұл  вакциналарды макроорганизмге енгізу қаншалықты қауіпсіз екендігі белгісіз [6]. Соңғы жылдары жануарлар мен адамдар үшін жоғары тиімді және қауіпсіз бруцеллездің иммунологиялық профилактикасын іздеу микроорганизмдерді инактивациялаудың жұмсақ әдістерін, сонымен қатар иммуногенділік қасиеттерін сақтауға мүмкіндік беретін бруцелланың құрылымдық компоненттерін оқшаулау әдістерін іздеуге бағытталған.

Микроорганизмдердің OMP жасуша мен оның қоршаған ортасының динамикалық интерфейсі ретінде қызмет етеді. Бұл белоктардың кейбір функцияларына жасушалық құрылымды сақтау, басқа клеткаларға адгезия және әртүрлі заттарды байланыстыру жатады. OMP сонымен қатар микробқа қарсы тұрақтылықтың маңызды элементтері болып табылады. Жасушадан микробқа қарсы затты белсенді түрде шығаратын ақуыздар (мысалы, ферменттер мен эффлюкс ақуыздары) организмнің тұрақтылығын дамытуда маңызды фактор болып табылады. Сонымен қатар, көптеген қоректік заттар мембрана арқылы сыртқы мембрананың интегралды ақуыздары (OTP) арқылы өтеді, олар жиынтығында пориндер деп аталады. Бұл триммерлік белоктар сыртқы мембранада ашық, сумен толтырылған каналдарды құрайды. Олар аминқышқылдары мен моносахаридтер сияқты аздаған гидрофильді ерітілген заттардың пассивті диффузия арқылы өтуін қамтамасыз етеді [7]. Басқа OMP-де ақуыз секрециясы және есірткінің экструзиясы мен ферменттер немесе сыртқы мембрананың құрылымдық компоненттері сияқты көбірек мамандандырылған автоматты функциялары бар. Интегралды OMP-мен қатар, мембранада N-терминалды липид фрагменті арқылы мембранаға бекітілген липопротеидтер де бар. [8]

Бруцеланың жасушалық қабырғасы сыртқы мембранамен мықтап байланысқан пептидогликан қабатынан тұрады (1-сурет).

Бруцелланың сыртқы қабықшасының сызбалық көрінісі (OM). Қысқартулар: NH ; LPS ; NH-L ; Кдо, 3-дезокси-D-манно-октулозон қышқылы; OL, орнитин липидтері; LP, бос липопротеин; ЛА, липид А; OMP3, OM 3 ақуыздар тобы; ПО, порин; ПК, фосфатидилхолин; B-LP байланыстырылған липопротеин; OMP, OM белоктары; OH-C28: 0, гидроксилденген C28: 0 май қышқылы.

Көптеген интегралды мембраналық ақуыздар, оның ішінде ішкі мембрананың ақуыздары толығымен гидрофобты амин қышқылдарынан тұратын α-спирт түрінде болады, бактериялық OMP-лер мүлдем басқа құрылымға ие. Бұл белоктар параллельді амфипатикалық str қатпарларынан тұратын β-бөшкелер құрайды [8]. Бұл β-жіптердегі гидрофобтық қалдықтар мембрананың липидті ортасының әсеріне ұшырайды, ал гидрофильді қалдықтар пориндер жағдайында су арнасы болып табылатын ақуыздың ішкі бөлігіне көрсетеді. Бұл β-бөшкелік құрылымдар өте тұрақты және протеаздарға жоғары төзімділікке ие.

Тиісті гендер бірізділікке ие болғанымен, 1-топтағы белоктардың табиғаты мен нақты рөлі әлі де көрінетін болады. Алайда, 2-топ пориндер ішінара сипатталды. Кейінгі жұмыстарда 2 және 3 топтардың гендері және бірнеше кіші OMP сипатталған. Таксономиялық және эпидемиологиялық қызығушылық тудыратын және бруцелланың эволюциясына жаңаша көзқараспен қарауға мүмкіндік беретін түрлердің, биовардың және штаммдардың деңгейіндегі негізгі ОМП гендері арасында әртүрлілік бар.

Кейбір OMP Brucella иммундық жауапты индукциялайды және Brucella spp қарсы иесі қорғауды белсендіре алады. Алайда, иесінде жұқтырылған немесе вакцинацияланған кейбір OMP тиісті иммунитетті ынталандыруы мүмкін, бірақ иесі сатып алған бруцеллезге қарсы қорғаныш иммундық механизмдерде шешуші рөл атқармауы мүмкін. 18-кДа OMP B. abortus сияқты қорғаныстық иммунитетті қамтамасыз етуге қатыспайтын, IFN-g өнімінің төменгі деңгейін спецификалық иммундық лимфоциттерден индукциялай алады [9].

Қазіргі уақытта қол жетімді серологиялық бруцеллез емдеу құралдары LPS компоненттеріне негізделген, алайда олар табиғи жұқтырғандарды вакцинацияланған Жануарлар B.abortus S19 ажырата алмайды. Адам сарысуында IgG және IgM өлшейтін диагностикалық құрал негізгі OMP B. melitensis стандартты препаратын пайдалана отырып ELISA көмегімен антиген ретінде адамдарда бруцеллалардың барлық түрлерінен туындайтын инфекцияларға антиденелер реакциясын өлшеу үшін пайдалы. B. abortus-тен алынған рекомбинантты OMP28 ELISA және латекс бисерді агглютинация сынағының (LAT) көмегімен ірі қара мал бруцеллезінің серодиагностикасы үшін қолданылды және оны жануарлардың әртүрлі түрлерінен түрлі үлгілерді скрининг үшін анықтау шаралары ретінде қолдануға болады [10]

Brusella OMP25 / OMP31 тұқымдасы күшті антигенділікті көрсетеді және оны бруцеллез диагнозын қою үшін қолдануға болады. Сонымен қатар, отбасы мүшелері бактериялық вируленттілікпен байланысты және әлеуетті қорғаныс антигендері болып табылады  Жақында жүргізілген зерттеу OMP25 / OMP31 отбасындағы ақуыздар иммунодоминантты антигендер ретінде жоғары сақталатындығын және бруцелланың вируленттілігімен байланысты екенін көрсетті. Сондықтан, біз осы зерттеуде OMP31 прокариоттық өрнек векторы, моноклоналды антиденелерді дайындалды, Escherichia coli-де оның экспрессиялық жағдайлары жасалынды. Батыс иммундық анализін қолдана отырып, Brucella OMP31 қарсы mAb-ның иммуногенділігі мен сипаттамаларына анықтама беріп,  OMP31-нің биологиялық сипаттамаларын зерттеуге негіз жасалынды [11] .