Актуальные аспекты лабораторной диагностики туберкулёза

Аннотация. В данной работе представлен обзор литературы, посвященный современным методам лабораторной диагностики  M. tuberculosis (МБТ) с учётом их преимуществ и недостатков. Сделаны выводы о том, что несмотря на наличие разнообразных методов в диагностике туберкулёза существует необходимость усовершенствования и разработки новых, высокоспецифичных и чувствительных методов диагностики.

Ключевые слова: Туберкулёз, лабораторная диагностика, методы исследования, обзор литературы.

Во всём мире насчитывается около 2 миллиардов человек, инфицированных M. tuberculosis, из этого числа у 10 миллионов развиваются активные формы заболевания, а около 1,6 миллионов погибают от туберкулёза [3, 15]. Активная форма туберкулёзной инфекции преимущественно поражает лёгкие, а передача возбудителя воздушно-капельным путём обуславливает высокую заразность данного заболевания.

Поэтому одним из актуальных вопросов современной фтизиатрии является разработка новых надёжных и быстрых методов диагностики туберкулёза, что является важным компонентом для подбора адекватной терапии заболевания и контроля его распространения в популяции.

Целью данной работы является литературный обзор современных методов лабораторной диагностики туберкулёзной инфекции.

Для диагностики и мониторинга туберкулёза в настоящее время используются различные методы исследования: клинические, микробиологические, молекулярно-генетические, лучевые. Однако среди них самым надёжным является непосредственное обнаружение возбудителя в материале больного методом ПЦР, остальные же информативны только в комплексе [1, 3, 5].

Наиболее доступным, быстрым и экономичным методом является бактериоскопическое исследование. Однако из-за низкой чувствительности данный метод позволяет выявить кислотоустойчивые микобактерии только при содержании их не менее 5000-10000 бактериальных клеток в 1 мл материала, поэтому при незначительной выраженности туберкулёзного процесса бактериоскопия имеет низкую диагностическую эффективность и высока вероятность получения ложноотрицательных результатов [3, 5].

В сравнении с микроскопией, культуральные методы диагностики отличаются наибольшей чувствительностью и имеют ряд преимуществ, среди которых возможность получения культуры возбудителя. Это позволяет подробно исследовать культуру, провести дальнейшею идентификацию и тестирование на лекарственную чувствительность. Однако данный метод является трудоёмким, дорогостоящим и длительным (результат посева можно получить не ранее, чем через 5-6 недель), так как требует наличия специализированных помещений для изготовления питательных сред и обработки образцов, а также обученного персонала [1, 11, 14].

Широкое распространение для диагностики туберкулёза получили системы автоматических микробиологических анализаторов типа BACTEC, принцип работы которых основан на флуоресцентной регистрации сигнала. Для посева обычно используются флаконы с жидкой питательной средой Миддлбрук и встроенным сенсором, на который нанесена специальная краска – флюорохром, ингибируемая кислородом. В случае присутствия в пробирке микроорганизмов флюорохром будет реагировать на уменьшение количества свободного кислорода, вследствие жизнедеятельности МБТ, что приведёт к модуляции свечения, которое абсорбируется флуоресцентным материалом в сенсоре. Фотодетекторы прибора измеряют уровень флюоресценции, зависящий от объёма выделяемого кислорода, а интерпретация результатов происходит в зависимости от установленных критериев, заложенных в программу. При выявлении положительных культур, BACTEC подаёт световой и звуковой сигнал, выводит данные на монитор [7, 9, 10].

К плюсам данного метода можно отнести: возможность диагностики в максимально короткие сроки — одновременное проведение 960 анализов, выявление микобактерии за 3-15 дней, определение чувствительности к антибактериальным препаратам за 7-9 дней, при этом высеваемость микобактерии туберкулёза составляет до 94%, а исключение необходимости ручной обработки – сводит к нулю ошибки, связанные с человеческим фактором.

Микробиологический анализатор BACTEC также позволяет определять чувствительность к препаратам первого ряда (стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу), пиразинамиду и препаратам второго ряда, в том числе, к новым препаратам. При этом специфичность метода составляет 100%, чувствительность - 92-98%, варьирование зависит от препарата [7].

Однако основным недостатком, ограничивающим возможность его широкого распространения и применения, является себестоимость проводимых анализов [2].

Длительность получения результатов культуральным методом исследования привело к разработке новых методов диагностики туберкулёза – молекулярно-генетических, основанных на выявлении в исследуемых образцах диагностического материала специфических фрагментов цепи ДНК возбудителя. Среди применяемых для этого молекулярно-биологических методик наиболее широкое распространение получил метод полимеразно-цепной реакции (ПЦР), направленный на амплификацию специфических участков генома микобактерии туберкулеза, их детекции и идентификации. Основное преимущество данных методов связано с тем, что они позволяют получить результаты в относительно короткий промежуток времени [3, 5, 14].

В настоящее время в Российской Федерации зарегистрировано большое количество тест-систем для выявления ДНК микобактерий методом ПЦР, различающихся способом детекции результатов, например, автоматизированная система GeneXpert MTB/RIF, которая включает в себя амплификацию нуклеиновых кислот и определение искомой последовательности в простых или комплексных образцах в режиме реального времени. В тест-системе используются одноразовые картриджи, благодаря которым исключается перекрёстная контаминацию образцов. Праймеры в анализе амплифицируют порцию гена rpoB, содержащего 81 пару комплементарных оснований нуклеиновых кислот, датчик способен дифференцировать дикую последовательность и мутации данного гена, ассоциированные с резистентностью к рифампицину [6]. Чувствительность и специфичность исследования по методу Xpert MTB/RIF для определения устойчивости к рифампицину составляют соответственно 99,1% и 100% [11].

Система GeneXpert позволяет обнаруживать за одно исследование до 12 уникальных последовательностей нуклеиновых кислот, это даёт возможность одновременно проводить как само исследование, так и контрольные измерения, предоставляя в итоге высоконадежные и стабильные результаты. Подключение к лабораторной информационной системе предоставляет оптимизированный порядок обработки образцов и позволяет получать достоверные результаты, а автоматизация процесса уменьшает количество ошибок и облегчает работу с базой данных по пациентам [9].

Еще одним способом молекулярно-генетической диагностики МБТ является тест-система Genotype MTBD, основанная на быстрой детекции наиболее частых мутаций, встречающихся в генах, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду и рифампицину. Кроме того, данная система позволяет одновременно определять и чувствительность к этим препаратам.

Механизм работы Genotype MTBD основан на обратной гибридизации амплифицированной ДНК штамма M. tuberculosis или иммобилизированными на нитроцеллюлозной полоске пробами ДНК [11]. Данный тест может проводиться на чистой культуре, взятой из пробы пациента или на самой пробе, что сокращает время получения результата, так как исключён этап культурального метода [12]. В добавок, версия Genotype 2.0, в отличии от версии 1.0, позволяет проводить исследования, как в положительных, так и в отрицательных мазках. Диагностическая чувствительность метода составляет 96 и 97 %, а специфичность - 90,7 и 83,3 %. Время получения ответа 1-2 дня [13].

Заключение: На сегодняшний день наиболее распространёнными методами лабораторной диагностики туберкулёзной инфекции по-прежнему остаются бактериологические, среди которых наибольшую эффективность и надёжность представляют микробиологические исследования на жидких питательных средах с помощью автоматического анализатора BACTEC. Среди его преимуществ: возможность проведения большого количества анализов, быстрое выявление микобактерий в срок от 3 дней, а также определение чувствительности к антибактериальным препаратам первого ряда.

“Золотым стандартом” в диагностике туберкулёза являются молекулярно-генетические методы: молекулярно-генетический картриджный тест GeneXpert MTB/RIF и генетическая тест-система Genotype MTBD. Автоматизированный тест GeneXpert предоставляет высоконадежные и стабильные результаты, позволяя диагностировать возбудителя туберкулёза в мокроте и определять чувствительность к рифампицину, а автономные одноразовые картриджи исключают возможность перекрёстной контаминации образцов, что сводит вероятность ошибки к нулю. Genotype MTBD показывает высокую диагностическую чувствительность и специфичность, позволяет определять устойчивость к препаратам второго ряда и использовать при исследовании как пробы чистой культуры, так и пробы, полученные сразу от пациента, но чувствителен к контаминации ввиду отсутствия одноразовой картриджной системы. В сравнении с GeneXpert, является наиболее технически сложным исследованием, занимающим больше времени.