РАЗРАБОТКА ПРОБИОТИКА НА ОСНОВЕ ШТАММА BACILLUS SUBTILIS И ЕГО АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Аннотация. В представленной статье рассматривается разработка пробиотического препарата на основе монокомпонентного штамма Bacillus subtilis, выращенного на мясо-пептонной среде. Пробиотик обладает выраженной антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, включая Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Salmonella typhimurium. Проведён сравнительный анализ чувствительности штамма к различным антибиотикам, подтверждающий его устойчивость к ряду препаратов и чувствительность к другим. Для сохранения биомассы и обеспечения её стабильности был применён многоступенчатый технологический процесс, включающий центрифугирование, фильтрацию, лиофилизацию и капсулирование. Использованы вспомогательные вещества (сахароза, магний стеарат и натрий цитрат) для повышения стабильности и удобства применения препарата.

Ключевые слова: Bacillus subtilis, пробиотик, антагонистическая активность, антибиотикоустойчивость, лиофилизация, капсулирование, биомасса.

Введение. Современная медицина и биотехнология всё чаще обращаются к применению пробиотиков — живых микроорганизмов, благотворно влияющих на здоровье хозяина при поступлении в достаточных количествах. Они используются в профилактике и терапии дисбактериоза, желудочно-кишечных расстройств, аллергических и аутоиммунных заболеваний, а также в пищевой и ветеринарной промышленности.

Особый интерес представляет использование спорообразующих пробиотиков, таких как Bacillus subtilis. Благодаря образованию устойчивых спор, этот микроорганизм способен выдерживать высокие температуры, низкую влажность и агрессивную среду желудочно-кишечного тракта, включая воздействие соляной кислоты и желчи. Такие свойства делают Bacillus subtilis привлекательным кандидатом для разработки термостабильных и долговечных пробиотических форм. Научная литература свидетельствует о высоком антагонистическом потенциале штаммов B. subtilis в отношении ряда патогенных микроорганизмов, включая Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. и других представителей условно-патогенной микрофлоры. Данный эффект достигается за счёт синтеза антимикробных соединений, таких как сурфактин, итурин и субтилизин.

Кроме того, важным критерием выбора пробиотического штамма является его чувствительность или устойчивость к антибиотикам. Это особенно актуально в свете растущей проблемы антибиотикорезистентности и необходимости комплексного подхода к лечению инфекций. Наряду с биологическими характеристиками, немаловажное значение имеет технология производства пробиотика. Этапы лиофилизации и капсулирования позволяют обеспечить длительное хранение препарата без потери активности, сохранить высокую жизнеспособность бактерий и облегчить применение конечного продукта в медицинской практике. Таким образом, актуальность настоящего исследования заключается в необходимости разработки эффективного, устойчивого и технологически пригодного пробиотического препарата на основе штамма Bacillus subtilis.

Цель исследования – оценить антагонистическую активность выделенного штамма Bacillus subtilis, определить его антибиотикочувствительность и разработать эффективную технологию получения капсулированной лиофилизированной формы пробиотика.

Материалы и методы.

1. Исходный штамм и условия культивирования В исследовании использовался штамм Bacillus subtilis, выделенный из природной среды и идентифицированный с использованием морфологических и биохимических признаков. Культивирование проводилось на мясо-пептонной бульонной среде (МПБ) при температуре 37 °C в течение 18–24 часов при постоянном перемешивании (150 об/мин). Выращивание проводилось в аэробных условиях с контролем pH и уровня загрязнённости.

2. Отбор и характеристика штамма. Отбор штамма проводился по следующим критериям:

- способность к образованию спор (под микроскопом — с применением окраски по Граму);

- антагонистическая активность в отношении патогенных микроорганизмов;

- устойчивость к антибиотикам;

- рост в стрессовых условиях (солёность до 10%, температура до 50 °C).

3. Оценка антагонистической активности. Методом двойного посева (штрих в штрих) на питательной среде определялась антагонистическая активность по отношению к:

- E. coli ATCC 25922

- S. aureus ATCC 6538

- S. typhimurium ATCC 14028

Инкубация чашек проводилась при 37 °C в течение 24 часов. После чего измеряли диаметр зоны подавления роста (мм) вокруг колоний B. subtilis.

4. Оценка чувствительности к антибиотикам. Определение чувствительности проводилось методом дискодиффузии. Использованы диски с 16 антибиотиками

- β-лактамы: ампициллин, цефазолин, оксациллин;

- аминогликозиды: гентамицин, стрептомицин;.

- макролиды: азитромицин, эритромицин;

- фторхинолоны: офлоксацин, ципрофлоксацин;

- другие: левомицетин, ванкомицин и др.

5. Получение и очистка биомассы. После культивирования биомасса отделялась центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут. Осадок промывался стерильным физиологическим раствором и фильтровался через мембранный фильтр 0.45 мкм для удаления примесей.

6. Лиофильная сушка (лиофилизация). Подготовленную биомассу подвергали лиофильной сушке в три этапа:

1. Замораживание: −40 °C на 8–12 ч;

2. Сублимационная сушка: −30 °C при 0.1–0.2 мбар на протяжении 18–24 ч;

3. Десорбция: 20–25 °C при остаточном давлении 0.01–0.05 мбар в течение 6–8 ч.

В качестве защитной матрицы использовалась 5% сахароза, что способствовало сохранению жизнеспособности спор.

7. Капсулирование пробиотика. Полученный порошок смешивали с формообразующими компонентами:

- Сахароза (дезинтегрант, криопротектор),

- Магния стеарат (смазывающее вещество),

- Натрия цитрат (буфер, стабилизатор pH).

Смесь засыпали в твердые желатиновые капсулы (размер №0) на капсуляторе ручного типа. Готовые капсулы фасовались во флаконы из затемнённого стекла и хранились при температуре 4–8 °C с контролем влажности (не выше 50%).

Результаты и обсуждение

1. Антагонистическая активность штамма Bacillus subtilis. Полученные результаты демонстрируют высокую антагонистическую активность штамма Bacillus subtilis по отношению к ряду патогенных микроорганизмов. На основании измерений диаметра зоны подавления роста были зафиксированы следующие значения:

- Escherichia coli ATCC 25922 — 18 мм

- Staphylococcus aureus ATCC 6538 — 21 мм

- Salmonella typhimurium ATCC 14028 — 16 мм

Эти данные подтверждают наличие у исследуемого штамма мощного антагонистического потенциала. Предположительно, антибактериальное действие обусловлено синтезом биологически активных веществ: сурфактина, субтилизина и других липопептидных соединений.

2. Антибиотикочувствительность. Штамм Bacillus subtilis проявил разную степень чувствительности к антибиотикам, что имеет значение для исключения передачи устойчивости в микробиоме. Результаты представлены в таблице:

Таблица 1.

Чувствительности к антибиотикам

Таким образом, штамм демонстрирует преимущественную чувствительность к макролидам и аминогликозидам, что благоприятно с точки зрения безопасного применения совместно с антибиотиками.

3. Качество лиофилизации. После проведения сублимационной сушки, биомасса сохранила структурную целостность и активность. Порошок обладал сыпучей текстурой, без запаха, светло-жёлтого цвета. Потери жизнеспособности спор после лиофилизации не превышали 8%, что соответствует стандарту для пробиотических препаратов.

Готовые капсулы с пробиотиком имели равномерное наполнение, без комков и пыли. Благодаря использованию вспомогательных веществ (сахароза, магния стеарат, натрия цитрат), препарат обладал хорошей текучестью, стабильностью и механической прочностью.

Заключение. Проведённое исследование подтвердило высокую эффективность штамма Bacillus subtilis как основы для создания пробиотического препарата. Выбранный штамм проявил выраженную антагонистическую активность в отношении условно-патогенных микроорганизмов, таких как Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Salmonella typhimurium, что свидетельствует о его потенциале в борьбе с инфекциями кишечного тракта. Результаты оценки антибиотикочувствительности показали, что штамм в основном чувствителен к макролидам и аминогликозидам, что делает его безопасным для применения на фоне антибактериальной терапии и минимизирует риск горизонтальной передачи устойчивости. Разработанная технология получения пробиотика с использованием лиофильной сушки и капсулирования обеспечивает высокую сохранность жизнеспособности клеток и удобную форму для потребления.