Полимеразная цепная реакция с электрофоретической детекцией продуктов амплификации

Одним из ведущих методов современной лабораторной диагностики в ветеринарной является полимеразная цепная реакция. Она высокочувствительна и специфична, ей свойственна высокая технологичность и надежность, возможность количественного определения патогенных микроорганизмов в исследуемом материале. ПЦР-диагностика более чувствительна, чем культуральные методы исследований, но ее результаты зачастую зависят от методики исследования, соответственно, результаты могут варьироваться. Особую ценность эта реакция имеет при выявлении возбудителей, которых трудно идентифицировать другими методами [1; 2].

Микоплазмы относятся к классу Mollicutes, порядку Mycoplasmatales, семейству Mycoplasmataceae, котрое представлено двумя родами, имеющими значение в патологии животных: Mycoplasma (76 видов) и Ureaplasma (2 вида) [3].

Для некоторых патогенных видов микоплазм доказана их первичная роль в этиологии болезней (микоплазмозов). У крупного рогатого скота – M. mycoides, M. agalactiae, M. alkalescens, M. bovirhinis, M. Bovis. Другие виды микоплазм встречаются как возбудители вторичных и смешанных инфекций или сопутствующих микробов при различных болезнях [1].

Целью настоящей работы явилось проведения метода полимеразной цепной реакции для диагностики микоплазмозов животных в классическом виде, методом выделения ДНК с использование сорбента; анализ достоинств и недостатков молекулярно-генетического метода диагностики микоплазмозов крупного рогатого скота.

Материалы и методы

Отбор клинического материала проводили согласно правилам асептики, за основу были взяты действующие правила и инструкциями по сбору и подготовке материала для исследования методом ПЦР в животноводческом комплексе Северо-западного региона(рис.1).

Рисунок 1. Животноводческий комплекс Северо-Западного региона

Мазки отбирали со слизистых оболочек носовой полости телят абердин -ангусской породы. Отобранные пробы помещали в пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл, содержащие 300–500 мкл стерильного физиологического раствора.

Синовинальную жидкость отбирали при оссифицирующем бурсите от быка абердин- ангусской породы.

Полученную из отобранных проб взвесь осаждали при 10 тыс. об/мин в течение 5 мин на центрифуге для пробирок Эппендорфа. Экстракцию ДНК проводили из 100 мкл осадка. Полученные образцы ДНК хранили при температуре +4°С в холодильнике.

Для проведения ПЦР мы воспользовались коммерческой тест-системой для ПЦР-диагностики микроорганизмов рода Mycoplasma «МИК-КОМ», производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва).

Тест-система была представлена тремя комплектами для каждого этапа исследования соответственно:

·     «АмплиПрайм ДНК–Сорб-АМ» – комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;

·     «ПЦР-комплект» – комплект реагентов для амплификации участка ДНК микроорганизмов рода Mycoplasma;

·     «ЭФ» – комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.

Выделение ДНК из отобранных образцов проводили с использованием оптимизированных коммерческих набора «АмплиПрайм ДНК–Сорб-АМ» (с сорбентом) в соответствии с инструкцией к данному набору. Для проведения амплификации были использованы готовые пробики Эппендорфа с заранее нанесенными праймерами. Для того, чтобы уменьшился риск образования неспецифических продуктов реакции амплификации, мы применили технологию “hot-start”. Для процесса амплификации использовали прибор «Терцик» производства ООО «ДНК Технология» (Москва).

Для проведения амплификации было проведено 3 этапа: денатурация ДНК при температуре 95ºС, отжига праймеров на денатурированной ДНК и элонгации (синтеза новой цепи с помощью фермента Taq-полимеразы при 72ºС).

Для проведения электрофоретической детекции брали соответствующий комплект реагентов, входящий в состав коммерческого набора, а также использовали камеру для электрофоретических разделений ПЦР-продуктов в агарозном геле (рис 3).

Рисунок 3. Камера для электрофоретических разделений ПЦР-продуктов в агарозном геле

Анализ электрофореграммм проводили с помощью фотосистемы (рис. 4).

Рисунок 4. Учёт результатов детекции продуктов амплификации в агарозном геле, 1 – отрицательный контроль, 2,3, 4,6,7 – положительные клинические образцы, 5 – отрицательный клинический образец, 8 – положительный контроль

Полосы электрофореграммы четкие, что свидетельствует о том, что в отобранных нами образцах содержатся нужные нам копии ДНК, результат можно признать положительным.

В качестве «положительного контроля» используют стандарт ДНК искомого микроорганизма. «Положительный контроль» позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции.

Отрицательные контроли (в качестве пробы буферные растворы наборов для растворения выделенных, ДНК-соответственно наборам.)

Заключение

Необходимо не только усовершенствовать имеющиеся, но и разрабатывать новые тест-системы для молекулярно-генетических методов диагностики инфекционных болезней крупного рогатого скота.

При диагностике микоплазмозов у крупного рогатого скота ветеринарному специалисту также следует учитывать эпизоотологические и клинические данные.

Безусловно, чтобы грамотно интерпретировать результаты культивирования или ПЦР, специалистам следует брать во внимание факт дачи лекарственных препаратов (в том числе антибиотиков) перед проведением диагностики. Имеющиеся в настоящий момент литературные данные свидетельствуют, что при обнаружении микоплазм рекомендуется также провести стандартное аэробное и анаэробное культивирование полученных образцов. Вероятно, животному следует назначать не только специфические препараты, к которым чувствительны микоплазмы, но и прочие противомикробные препараты, к которым чувствительны выделенные бактерии других родов. Ну и, конечно же, подозрение на инфекцию, вызванную микоплазмами, заставляет задуматься об иммунном статусе исследуемого животного.