Разработка подходов к получению оптически чистой D-молочной кислоты

Development of approaches for production of optically pure D-lactic acid

Khaliullin Ilyas

Candidate of Science, senior researcher, Moscow Institute of Physics and technology(State University), Russia, Dolgoprudny

Аннотация. С целью создания метода производства оптически чистого D-лактата разработан способ скрининга молочнокислых культур. Данный подход включает ВЭЖХ анализ культуральных жидкостей на содержание молочной кислоты и хиральный анализ с использованием метода кругового дихроизма. Подход позволяет быстро оценить процессивность и стерео специфичность лактатдегидрогеназ молочно кислых культур.

Abstract. The method of lactic acid strains screening was developed for the purpose of construction of the process for production of optically pure D-lactate. The method involves HPLC analysis of culture liquids for lactic acid content and chiral analysis using circular dichroism. The developed method enables rapid estimation for effectiveness and stereospecificity of lactate dehydrogenases in lactic acid producing strains.

Ключевые слова: D-молочная кислота; скрининг; биосинтез, оптическая чистота, круговой дихроизм.

Keywords: D-lactic acid; screening; biosynthesis, opticalpurity, circular dichroism.

Молочная кислота издавна широко используется в самых различных областях человеческой деятельности: в производстве пищевых продуктов и кормов для животных в качестве подкислителя и консерванта, в кожевенном производстве, в текстильной промышленности, как вспомогательное средство для крашения и печати, как средство для очистки, дезинфекции и нейтрализации [4, 6, 7]. При этом, поскольку только L-изомер молочной кислоты является биологически активной формой, которая быстро и целиком утилизируется организмом человека или животного, основные усилия в конструировании продуцентов молочной кислоты были традиционно направлены на получение L-изомера.

В последние годы наиболее значимой и быстро развивающейся областью применения молочной кислоты является производство биологически разлагаемого полимера молочной кислоты – полилактида (ПЛА) [1].

Из полилактида возможно производство таких продуктов, как: покрывающая пленка для сельского хозяйства, системы укрепления грунта для садоводства, хирургические нити, штифты и другие одноразовые изделия медицинского назначения, а также одноразовая посуда и упаковка для продовольственных продуктов и товаров широкого потребления. Однако свойства полилактида зависят от соотношения входящих в его состав оптических изомеров. Высокомолекулярные полилактиды, полученные из смеси изомеров, вследствие случайной ориентации заместителей в полимерной цепи не обнаруживают кристалличности и не используются для получения волокон. Традиционно получают полилактид из чистой L-молочной кислоты (L-ПЛА), имеющий высокую степень стереорегулярности и кристалличности. Серьезным ограничением сферы применения L-ПЛА является его низкая температура плавления (170-180°C).

В последние годы было показано, что возможен новый тип полилактида – стереокомплекс, представляющий собой смесь чистого L-ПЛА и чистого D-ПЛА в равных соотношениях. Сплетение двух полимерных цепей L-ПЛА и D-ПЛА и образование дополнительных взаимодействий между ними ведет к повышению температуры плавления до 220 °C [5]. Такой стерео комплекс также применяется в набирающей популярность 3D-печати, составляя конкуренцию загрязняющему окружающую среду ABS-пластику. Таким образом, ориен­тация на производство ПЛА-стереокомплекса значительно увели­чивает интерес к промышленному производству D-молочной кислоты.

Молочная кислота в клетке синтезируется из оптически неактивного пирувата. Синтез осуществляет NADH-зависимый фермент лактатдегидрогеназа (LDH), в зависимости от своего строения производящий либо L-, либо D-молочную кислоту. Пируват является конечным продуктом гликолиза и накапливается в клетке в условиях кислородного голодания. Помимо превращения в молочную кислоту, пируват также может ферментативно декарбоксилироваться и затем восстанавливаться до этанола. Эти процессы, протекающие, например, в дрожжах, катализируют ферменты пируватдекарбоксилаза (PDC) и алкоголь дегидрогеназа (ADH) соответственно. В аэробных же условиях основным путем метаболизма для пирувата является его вовлечение в виде ацетил-кофермента А в цикл Кребса, служащий источником широкого ряда органических кислот. Таким образом, производство молочной кислоты с использованием микроорганизма-продуцента осложнено многочисленными побочными путями, снижающими выход продукта, а сам процесс является двухстадийным: на первой аэробной стадии происходит наращивание клеточной массы, на второй – анаэробной – непосредственный синтез продукта.

Для получения оптически чистой D-молочной кислоты в настоящее время предложен ряд биокаталитических методов, основанных на стереоселективном молочнокислом брожении доступных источников углеводов, таких как отходы сахарной, рисовой промышленности и производства биодизеля[2, 3]. Продуцентами
D-молочной кислоты в данных методах являются либо природные штаммы с преобладающей активностью лактатдегидрогеназыD-типа, улучшенные селекционными методами, либо генно-инженерные штаммы, у которых нарушена способность к синтезу L-изомера молочной кислоты и, наоборот, активизирован синтез D-изомера [8, 9]. Необходимо отметить, что работы по направленному созданию продуцентов D-молочной кислоты активно ведутся за рубежом, а в России практически не проводятся. Потенциал же создания штаммов-продуцентов D-молочной кислоты далеко не исчерпан.

Наиболее перспективным путем получения оптически чистой
D-молочной кислоты с использованием микроорганизмов на наш взгляд является генно-инженерный подход, при котором в геном природного микроорганизма, осуществляющего синтез молочной кислоты, методами генетической инженерии встраиваются гены лактатдегидрогеназD-типа, а собственные лактатдегидрогеназыL-типа подавляются, как и гены ферментов, ответственных за побочные реакции превращения пирувата. Отдельными задачами в таком случае становятся выбор удобного микроорганизма-реципиента и поиск наиболее продуктивной и стереоспецифичной D-лактатдегидрогеназы.

Поиск подходящих D-лактатдегидрогеназ было решено прово­дить среди молочнокислых микроорганизмов коллекции ВКПМГосудар­ственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика). Отобранные микроорганизмы растились в стандартной среде LBпри 37 °Cв течение 12 часов в пробирках при активной аэрации (скорость качания 200 об/мин). После этого в пробирки добавляли раствор глюкозы до концентрации 10 г/л и порошкообразный мел. Пробирки закрывали герметично и оставляли на 24 часа в термостате на 37 °C, периодически встряхивая. Далее пробы центрифугировали, а надосадочную жидкость отбирали для анализа. Первичный анализ содержания молочной кислоты в пробах проводили при помощи метода ВЭЖХ с кондуктометрической детекцией. Анализ стереохимического состава синтезируемого лактата проводили при помощи разработанного метода измерения кругового дихроизма(КД) света, проходящего через исследуемые растворы с использованием спектрометра Jasco 1100. Все растворы при измерении КД разбавлялись в 100 раз дистиллированной водой.

Рисунок 1. Спектры кругового дихроизма чистой среды LB (красный) и надосадочной жидкости, содержащей оптически чистый лактат (синий)

Проведенное исследование позволило оценить процессивность и стерео специфичность лактатдегидрогеназ отобранных штаммов, а следовательно провести скрининг молочнокислых штаммов с целью дальнейшего отбора генов стереоспецифичных лактатдегдрогеназ для получения генно-инженерного высокоэффективного продуцента оптически чистого лактата.