СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК ПРИ ПОДГОТОВКЕ БИБЛИОТЕК ДЛЯ NGS: СОНИКАЦИЯ И ТАГМЕНТАЦИЯ

COMPARISON OF DNA FRAGMENTATION METHODS IN THE PREPARATION OF LIBRARIES FOR NGS: SONICATION AND TAGMENTATION

Elizaveta Kosacheva

Research assistant, DNA-Technology LLC, Russia, Moscow

Tatjana Jankevic

Research assistant, DNA-Technology LLC, Russia, Moscow

Аннотация. В последние годы метод секвенирования нового поколения (NGS) получил широкое распространение в молекулярной биологии и генетике, что обусловлено его высокой чувствительностью и возможностью одновременного анализа множества образцов. Однако успешность NGS зависит не только от самой технологии секвенирования, но и от предварительной подготовки библиотек ДНК. В данной статье приводится сравнительный анализ двух основных методов фрагментации ДНК: соникации и тагментации. Исследуются особенности и преимущества каждого из методов, их влияние на качество и количество получаемых библиотек.

Abstract. In recent years, new generation sequencing (NGS) method has become widespread in molecular biology and genetics, due to its high sensitivity and the possibility of simultaneous analysis of multiple samples. However, the success of NGS depends not only on the sequencing technology itself, but also on the preliminary preparation of DNA libraries. This article provides a comparative analysis of two main methods of DNA fragmentation: sonication and tagmentation. The features and advantages of each of the methods, their impact on the quality and quantity of the resulting libraries.

Ключевые слова: NGS, фрагментация ДНК, соникация, тагментация, подготовка библиотек.

Keywords: NGS, DNA fragmentation, sonication, tagmentation, library preparation.

С каждым годом технология секвенирования следующего поколения (Next-generation sequencing (NGS)) обретает больший спектр применения в научной и клинической сферах. Её применяют для чтения биологических данных с нуклеиновых кислот, одиночных клеток или белков. Использовав NGS, можно определить генетические перестройки (мутации, делеции или вставки в различных местах генома). Данное исследование возможно проводить сразу для большого количества образцов, что значительно сокращает время работы. [1]

В клинической практике, в частности в сфере онкологии, молекулярное профилирование с помощью метода секвенирования нового поколения используется для идентификации уникальных вариантов генов, которые связаны с опухолью, что облегчает их точную диагностику, а также способствует оптимальному выбору целевых методов лечения, соответствующих вариантам генов. Благодаря использованию NGS для многих пациентов стал возможен индивидуальный выбор тактики лечения, а также большой скачок развития для персонализированной медицины. [2]

Этап предварительной подготовки библиотек для проведения NGS оказывает большое влияние на получение высококачественных данных. При работе с библиотеками необходимо проводить фрагментацию ДНК. Существует несколько способов: химический, ферментативный и физический. Частое применение находят физический, получение фрагментов с помощью ультразвука (соникация), и ферментативный методы – использование транспозаз.

В качестве прибора для соникации широко используется Covaris. Этот прибор осуществляет нарезку ДНК произвольным способом с помощью непрямого действия. Чтобы получить фрагменты необходимой длины, регулируют интенсивность ультразвука и длительность обработки, таким образом возможно получить фрагменты от 150 до 5000 п. о. Длина вставки существенно влияет на последующее обогащения для проведения секвенирования.

Проведение нарезки ДНК с помощью соникации имеет ряд преимуществ. Предполагается, что использование ультразвука снижает потери ДНК при её фрагментации. Также, как было описано ранее, за счёт непрямой работы с образцами возможно исключить их контаминацию, особенно если работа происходит сразу с большим количеством образцов (в зависимости от модели, в прибор возможно поместить планшет – 96 образцов), что часто бывает в рамках клинической практики.  После ультразвуковой фрагментации нет необходимости проводить этап отбора фрагментов по размеру, как это делается при ферментативной нарезке, что сокращает затрачиваемое время на приготовление библиотек для NGS. При анализе данных также снижается доля ПЦР-дубликатов. [3]

В ферментативной обработке часто используется транспозазы (Tn5). Процесс, в котором они используются для  фрагментации ДНК – тагментацией. Эти ферменты вырезают фрагмент ДНК и перемещают его на другое место. При приготовлении библиотек для NGS используются модифицированные транспозазы – к ним пришиты адаптеры для последующего секвенирования. Такое изменение фермента позволяет в одной пробирке провести реакцию фрагментации и присоединения адаптера к концу нарезанного фрагмента с обеих сторон. [4] Это помогает исключить отдельный этап пришивания адаптеров, как это требуется при соникации. При ферментативной фрагментации происходит нарезка последовательностей длинной от 100 до 700 п.о.

При ПЦР пришитые адаптеры используются как место посадки праймера для увеличения количества продукта при подготовке библиотек, но на данном этапе возможно возникновение ошибок. Такие ошибки оказывают влияние на дальнейший анализ делеций и вставок в генотипе, из-за возникающих ошибок вероятность достоверного определения изменений в этих случаях ниже, чем при соникации. Однако при использовании инструментов для фильтрации гомополимерных ошибок (небольшие вставки из повторяющихся одиночных нуклеотидов) и объединением прочтений фрагментов, возможно восстановить изначальную последовательность и с той же точностью, как при ультразвуковой обработке, определить изменения в ДНК образца. [5]

Выбор технологии фрагментации зависит от нужд лабораторий и их возможностей. Так, например, для исследований экзома человека требуются вставки определённого размера – 200-330 п. о., так как около 80% таких участков на хромоcомах длинной менее 200 п.о. [6]

Таким образом, этап предварительной подготовки библиотек для проведения секвенирования нового поколения является критически важным для обеспечения высококачественных данных. Выбор технологии фрагментации ДНК должен основываться на потребностях и ресурсах лабораторий. При этом для успешного выполнения проектов, таких как исследование экзома человека, необходимо учитывать оптимальный размер вставок, что подчеркивает важность точности в процессе фрагментации. В конечном итоге, правильный выбор методов фрагментации и их грамотное применение играют ключевую роль в достижении надежных и воспроизводимых результатов в исследованиях, связанных с секвенированием ДНК.