Определение с помощью метода экспресс-диагностики вирусных заболеваний растений на начальных этапах заражения патогеном

Аннотация. Представлены результаты исследования по заражению растений N. benthamiana белком Р19, имеющимся в TBSV (Tomato bushy stunt virus) для последующей диагностики новым экспресс методом определения вирусных заболеваний на начальных этапах заражения. Установлена возможность определения наличия вируса в растении на начальных этапах заражения. Предложенный метод позволяет в кратчайшие сроки и с низкими затратами проводить экспресс-диагностику вирусных заболеваний.

Ключевые слова: экспресс-диагностика; вирусные заболевания; растения.

На протяжении многих лет и в настоящее время ущерб, наносимый вирусами на сельскохозяйственные угодья несоизмеримо велик. Ухудшается качество растительности, понижается его устойчивость к грибным и бактериальным заболеваниям, а также к абиотическим стрессам. Растения не могут реализовать свой потенциал урожайности, снижаемый в зависимости от вида вируса на 15%-50%. В данное время известно около 4000 видов вирусов, из которых около 1000 пагубно влияют на растения. Поэтому все чаще и чаще эта проблема рассматривается как серьезная угроза продовольственной безопасности. Этот вопрос касается всех продовольственных, кормовых и технических культур, возделываемых в любом регионе мира, и особенно актуален для вегетативно размножаемых растений, поскольку прогрессирующее накопление вирусов в ряду поколений приводит к полному заражению и вырождению сорта. Ежегодные убытки, причиняемые вирусами одной культуры в определенном регионе, нередко выражаются сотнями миллионов и миллиардами долларов [1], [3], [8], [12], [15].

В противовес вирусным заболеваниям у организмов выработался механизм РНК-интерференции (RNAi), являющийся одним из основных клетке. RNAi довольно важна не только в процессах сохранения стабильности и деградации мРНК, но также в управлении процессами трансляции мРНК, транскрипции генов, поддержании структуры хроматина и целостности генома [6]. Изначально этот механизм у растений получил название посттранскрипционного молчания генов или PTGS (от Post-Transcriptional Gene Silencing) и рассматривался в качестве основного клеточного механизма защиты от вирусов [14].

Было также установлено, что многие вирусные белки способны подавлять (супрессировать) клеточный процесс RNAi (RSS-белки – от RNA silencing suppressor proteins) и тем самым обеспечивать преимущество вирусов при размножении в клетках растений [11], [14]. К настоящему времени для некоторых растительных вирусов RSS-белки установлены и показаны молекулярные механизмы их функционирования [2], [5], [11]. К таким белкам относится Р19, имеющийся в TBSV (Tomato bushy stunt virus), которыми мы и заражали образцы растений N. benthamiana для последующей диагностики новым методом [7], [9], [10].

Таким образом успех борьбы с вирусными заболеваниями во многом зависит от того, в какой степени специалисты применяют в своей практической деятельности современные методы исследований. Значительную помощь при определении болезней растений может оказать знание физиологических и биохимических свойств больного растения. Кроме того, очень важно ознакомиться с условиями внешней среды больного растения и установить, какие факторы препятствуют развитию болезни, а какие, наоборот, способствуют ей.

Одним из главных средств для предупреждения проникновения и распространения вирусов и других системных заболеваний является их своевременная (ранняя) диагностика.

Диагностика заболевания растений вирусом довольно трудоемкий процесс, тем более сложно определить это на начальных этапах заражения патогеном. Подобных методов практически не существует или приме­няются те, которые требуют большую затрату времени и средств [4]. Таким образом, метод экспресс-диагностирования растений на начальных этапах заражения патогеном является новым в своей сфере.

Как было указано выше, у эукариотов выработался защитный механизм против вирусов, называемый РНК-интерференцией (RNA interference (RNAi)), который играет важную биологическую роль в регуляции экспрессии генов. Показано также, что RNAi является адаптивным защитным молекулярно-иммунным механизмом, направлен­ным против вирусных заболеваний. Антивирусная RNAi инициируется с генерации коротких интерферирующих РНК (short interfering RNAs (siRNAs)), которые используются в последующем распознавании и деградации вирусных молекул РНК. В ответ на защитную реакцию растений большинство вирусов кодируют специфические белки, способные противодействовать RNAi, этот процесс известен как супрессия RNAi. Вирусные супрессоры действуют на различных этапах RNAi и обладают биохимическими свойствами, которые позволяют им эффективно противодействовать защитной системе растений. Современ­ные молекулярные и биохимические исследования нескольких вирусных супрессоров значительно расширили наше понимание всей сложности природы супрессии RNAi, а также механизмов взаимодействия между вирусами и растениями [2], [13], [16].

Суть РНК-интерференции заключается в разрушении молекул РНК, несущих информацию о структуре гена, после присоединения к ним малых РНК, циркулирующих в цитоплазме клетки. Клеточный механизм РНК интерференции был, очевидно, выработан в процессе эволюции в большинстве эукариотических клеток в качестве превентивного средства защиты от РНК содержащих вирусов [2].

Материалы и методы исследования. Для переноса транскриптов с агарозного геля на нитроцеллюлозную, либо нейлоновую мембрану используются первичные и вторичные антитела с меченным ферментом к транскриптам TBSV, на месте успешного связывания которых появятся бэнды.

Берется большая посуда, примерно 20х25, в нее заливается 1ХТВЕ. Поверх посуды кладется стекло. На стекло укладывается фильтро­вальная бумага, так чтобы края бумаги находились в буфере. Затем сверху укладывается 1% агарозный гель с транскриптами TBSV посередине бумаги, поверх которого кладется нейлоновая или нитроцеллюлозная мембрана, которая должна покрывать именно площадь наличия бэндов на геле. Для удобства можно ее предельно аккуратно разрезать. Важно следить за тем, чтобы не оставалось пузырьков между гелем и мембраной, так как этот участок может не перенестись на нитроцеллюлозную мембрану. После чего 3, 4 слоя фильтровальной бумаги складываются сверху. Вся площадь стекла покрывается целлофаном, лишь участок, где расположен гель, остается открытым. Целлофан не даст фильтровальной бумаге высохнуть в течение проведения данного метода. Сверху укладывается большая стопка бумаги (салфеток), что создаст направление движения буфера снизу-вверх и тем самым перенесет образцы с геля на мембрану. На бумагу кладется стекло для создания ровной поверхности, так как сверху укладывается какой-либо предмет, массой 300-400 г. В таком положении оставляется на всю ночь при комнатной температуре.

Для проверки образования cross linking нитроцеллюлозная, либо нейлоновая мембрана аккуратно переносится под ультрафиолет в трансиллюминатор на 10 мин. Мембрана кладется в посуду, в которую заливается Blocking Solution. Blocking Solution применяется для закрытия свободных пор, а те участки, где прошел cross linking останутся без изменений. Для приготовления Blocking Solution потребуется 3,5 гр сухого молока и 50 мл TBS/TWEEN. Посуда кладется в термошейкер на 35^оС на 30 мин. По истечении времени выливается и заливается 1ХTBS/TWEEN. Переносится в термошейкер на 10-15 мин при 35^оС. Буфер выливается, и мембрана заливается первичными антителами, которые связываются с соответствующими антигенами. Перемещается в термошейкер на 60 мин. Промывается 2-3 раза 1ХTBS/TWEEN в течение 15-30 мин. Затем заливаются вторичные меченные антитела, которые связываются уже с имеющимися первичными антителами на мембране. Меченные вторичные антитела проявляют флуоресцирующие свойства при реакции с NBT BCIP. Комбинация из NBT (nitro-bluetetrazoliumchloride) и BCIP (5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphatep-toluidinesalt) продуцирует интенсивный, нерастворимый темно-фиолетовый осадок, когда реагирует с щелочной фосфатазой, и широко применяется в качестве конъюгата для антител. Инкубируется мембрана в термошейкере также в течение 60 мин, после чего промывается 2-3 раза 1ХTBS/TWEEN в течение 15-30 мин. После чего посуда с мембраной переносится в темную комнату и промывается NBTBCIP в течение 10‑15 мин до появления окраски на местах наличия вируса.

Инокулированные растения оставили в темном помещении на 24 часа. После чего растения растут при нормальных условиях в течение 7 суток. После чего мы проверили на наличие зараженности у растений N. benthamiana и 157 s. N. benthamiana. На приведенном ниже рисунке (1а, 1б, 1в, 1г, 1д) видно, что растения N. benthamiana и 157 s. N. benthamiana успешно заразились вирусом TBSV, о чем говорит некроз в растениях, скрученные листья и коллапс на нижних ярусах растения. Конечный недельный результат можно заметить на рисунке 1.

Чтобы определить наличие вируса в растениях мы провели экспресс-диагностику вирусных заболеваний растений на начальных этапах заражения патогеном. Для этого мы гомогенизировали растения ТЕ (TRIS/EDTA) буфером. После чего процентрифугировали в течение 25 мин при 10000 об/мин.

Полученный супернатант занесли с 6Х погружающим буфером (LoadingDye) в агарозный гель и получили нижеприведенный рисунок 2.

Рисунок 1. Признаки зараженности растений

Рисунок 2. Результаты определения наличия вируса в растениях на агарозном геле: 1,2 лунки-контрольные растения, 3 лунка – 157s. N. benthamiana зараженное вирусом TBSV, 4 лунка – N. benthamiana, зараженное вирусом TBSV

Результаты и обсуждение. Чтобы доказать успешное проведение новой, введенной нами методики экспресс-диагностики, которая проявляет реакцию на антитела, наши образцы с агарозного геля переносятся на нитроцеллюлозную мембрану. Перенесенные образцы проверяем первичными антителами, связывающимися с вирусом TBSV и затем вторичными меченными щелочной фосфатазой, связывающимися с первичными антителами. После чего, проявляем субстратом NBT/BCIP. Вследствие чего на мембране появляются окрашенные бэнды, содержащие вирус (Рисунок 3).

Рисунок 3. Экспресс–диагностика вирусных заболеваний растений на начальных этапах заражения патогеном на нитроцеллюлозной мембране

1 – N. benthamiana, зараженное вирусом TBSV; 2 – 157s. N. benthamiana, зараженное вирусом TBSV; 3,4 – контрольные образцы растений N. benthamiana и 157s. N. benthamiana, соответственно

Выводы

Предлагая метод экспресс-диагностики для определения вирусных заболеваний на начальных этапах заражения патогеном, мы доказали, что возможно определить наличие вируса в растении еще на начальных этапах заражения. Ведь на сегодняшний день существует огромное количество диагностирования растений, но только не в такие кратчайшие сроки, а если такие и имеются, то требуют огромной затраты средств.