КВАНТИФИКАЦИЯ ТРАНСКРИПТОМА КАРТОФЕЛЯ (Solanum tuberosum) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДАННЫХ Illumina И СБОРКИ Trinity: ЗНАЧЕНИЕ, МЕТОДОЛОГИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ

Аннотация. В данной работе представлен подробный анализ процесса квантификации транскриптома картофеля (Solanum tuberosum) с использованием данных секвенирования Illumina. Проведены этапы предварительной обработки данных, сборки транскриптома с помощью Trinity и последующая квантификация экспрессии транскриптов с использованием программы Salmon. Особое внимание уделено обсуждению значимости квантификации в контексте геномных исследований, историческому развитию методов квантификации и их роли как критического промежуточного этапа между сборкой транскриптома и последующим аннотированием и дифференциальным анализом экспрессии генов. Приведены реальные примеры работ авторов, внесших значительный вклад в область квантификации транскриптомов. Полученные результаты могут служить основой для дальнейших исследований, направленных на улучшение культурных свойств картофеля и понимание его генетической регуляции.

Ключевые слова: квантификация транскриптома, Solanum tuberosum, Trinity, Salmon, RNA-Seq, биоинформатика.

Введение

Картофель (Solanum tuberosum) является одной из наиболее важных сельскохозяйственных культур во всем мире, играя ключевую роль в обеспечении продовольственной безопасности. Понимание его генетической архитектуры и регуляции генов критически важно для улучшения сортов, повышения устойчивости к болезням и стрессовым факторам окружающей среды.

Квантификация транскриптома — это процесс измерения уровней экспрессии генов на основе данных РНК-секвенирования (RNA-Seq). Она служит важным промежуточным этапом между сборкой транскриптома и последующим аннотированием и дифференциальным анализом экспрессии генов. Без точной квантификации невозможно определить, какие гены активно экспрессируются, как они регулируются и как их экспрессия меняется в ответ на различные условия.

Значимость квантификации в геномных исследованиях

Квантификация транскриптома позволяет исследователям:

• Идентифицировать гены с дифференциальной экспрессией, что важно для понимания биологических процессов и ответных реакций организма.
• Изучать регуляторные сети генов, определяя, как гены взаимодействуют между собой.
• Анализировать сплайсинговые варианты и посттранскрипционные модификации.
• Оценивать эффективность генетических вмешательств, таких как генная терапия или генная инженерия.

История развития методов квантификации

Первоначально уровни экспрессии генов измерялись с помощью методов, основанных на гибридизации, таких как микрочипы ДНК. Однако с появлением технологий секвенирования нового поколения (NGS) стало возможным более точно и масштабно измерять экспрессию генов. Развитие алгоритмов для выравнивания и квантификации, таких как RSEM (Li & Dewey, 2011), Kallisto (Bray et al., 2016) и Salmon (Patro et al., 2017), значительно повысило точность и скорость анализа данных RNA-Seq.

Цель исследования

Цель данной работы — подробно описать процесс квантификации транскриптома картофеля, подчеркнув его значение как критического этапа в геномных исследованиях. Мы использовали данные секвенирования Illumina, программный инструмент Trinity для сборки транскриптома и Salmon для квантификации экспрессии транскриптов. Кроме того, мы обсуждаем важность квантификации в контексте современного геномного анализа и приводим примеры работ ведущих исследователей в этой области.

Материалы и методы

Исходные данные

Для исследования были использованы данные RNA-Seq, полученные с платформы Illumina HiSeq. Данные представляли собой парные чтения (paired-end reads) в формате FASTQ, сжаты в файлы с расширением .fq.gz. Были собраны образцы из трех экспериментальных групп картофеля и контрольного образца:

├── plant1

│   ├── 281_1.fq.gz

│   ├── 281_2.fq.gz

│   ├── 282_1.fq.gz

│   ├── 282_2.fq.gz

│   ├── 283_1.fq.gz

│   └── 283_2.fq.gz

├── plant2

│   ├── 461_1.fq.gz

│   ├── 461_2.fq.gz

│   ├── 462_1.fq.gz

│   ├── 462_2.fq.gz

│   ├── 463_1.fq.gz

│   └── 463_2.fq.gz

├── plant3

│   ├── 1011_1.fq.gz

│   ├── 1011_2.fq.gz

│   ├── 1012_1.fq.gz

│   ├── 1012_2.fq.gz

│   ├── 1013_1.fq.gz

│   └── 1013_2.fq.gz

├── reference

│   ├── P1_1.fq.gz

│   ├── P1_2.fq.gz

│   ├── P2_1.fq.gz

│   ├── P2_2.fq.gz

│   ├── P3_1.fq.gz

│   └── P3_2.fq.gz

Предварительная обработка данных

Для повышения надежности и статистической значимости результатов каждый образец был разделен на три биологических реплики. Данные были реорганизованы следующим образом:

data_processed/

├── plant1_rep1

│ ├── 281_1.fq.gz

│ └── 281_2.fq.gz

├── plant1_rep2

│ ├── 282_1.fq.gz

│ └── 282_2.fq.gz

├── plant1_rep3

│ ├── 283_1.fq.gz

│ └── 283_2.fq.gz

 ... (аналогично для plant2, plant3 и reference)

Контроль качества чтений

Перед сборкой транскриптома был проведен контроль качества исходных чтений с использованием программы FastQC (Andrews, 2010). Низкокачественные чтения и адаптерные последовательности были удалены с помощью инструмента Trimmomatic (Bolger et al., 2014).

Сборка транскриптома с помощью Trinity

Сборка транскриптома проводилась с использованием программы Trinity версии 2.14.0 (Grabherr et al., 2011). Trinity использует подход de novo сборки, что особенно важно в отсутствие высококачественного референсного генома.

Команда для запуска Trinity:

После сборки были получены файлы:

• Trinity.fasta — содержит собранные транскрипты.
• Trinity.fasta.gene_trans_map — содержит информацию о соотношении генов и транскриптов.

Квантификация экспрессии транскриптов с помощью Salmon

Для квантификации экспрессии транскриптов использовалась программа Salmon версии 1.9.0 (Patro et al., 2017). Salmon использует алгоритмы квантования без выравнивания, что значительно ускоряет процесс.

Процесс состоял из двух этапов:

Этап 1: Индексирование сборки транскриптома

Этап 2: Квантификация экспрессии

Параметр --validateMappings улучшает точность, используя более строгие критерии выравнивания.

Организация данных квантификации

Полученные файлы quant.sf для каждого образца были структурированы для дальнейшего анализа:

quant_results/

├── plant1_rep1_quant/

│ └── quant.sf ... (аналогично для остальных образцов)

Статистический анализ

Для статистического анализа использовался язык программирования R и пакеты из экосистемы Bioconductor, включая DESeq2 (Love et al., 2014).

Результаты

Контроль качества и предварительная обработка

Анализ с помощью FastQC показал высокое качество исходных данных. После очистки с помощью Trimmomatic общее количество чистых чтений для каждого образца составило в среднем 50 миллионов парных чтений.

Сборка транскриптома

Сборка с помощью Trinity позволила получить качественные транскрипты для каждого образца. Основные статистические показатели сборки представлены в таблице 1.

Таблица 1.

СТАТИСТИКА СБОРКИ ТРАНСКРИПТОМА

Квантификация экспрессии транскриптов

После квантификации были получены файлы quant.sf для каждого образца. Для каждого образца были идентифицированы топ-10 наиболее экспрессируемых транскриптов (см. Приложение A).

Анализ топ-10 транскриптов

Анализ показал вариабельность в наборах топ-10 транскриптов между различными репликами и образцами. Значения TPM для наиболее экспрессируемых транскриптов варьировали от ~5,000 до ~20,000.

Таблица 2.

Средние значения TPM для топ-10 транскриптов

Общие наблюдения

• Вариабельность между репликами: Существенные различия в наборах топ-10 транскриптов между репликами могут указывать на биологическую или техническую вариабельность.
• Высокоэкспрессируемые транскрипты: Наличие транскриптов с высокими значениями TPM может свидетельствовать о ключевых генах, активно функционирующих в данных условиях.

Обсуждение

Значение квантификации в геномных исследованиях

Квантификация транскриптома является критическим этапом в анализе данных RNA-Seq. Она позволяет измерить уровни экспрессии генов, что является основой для дальнейшего аннотирования и дифференциального анализа экспрессии (Roberts et al., 2011).

Вариабельность экспрессии между репликами

Наблюдаемая вариабельность между биологическими репликами может быть обусловлена:

• Биологическими факторами: Различия в физиологическом состоянии растений, условиях выращивания.
• Техническими факторами: Различия в подготовке библиотек, эффективности секвенирования.

Важно учитывать эту вариабельность при проведении статистического анализа и интерпретации результатов (Schurch et al., 2016).

Роль высокоэкспрессируемых транскриптов

Высокоэкспрессируемые транскрипты, идентифицированные в топ-10, могут быть связаны с основными метаболическими путями, необходимыми для жизнедеятельности клеток картофеля. Эти гены могут быть перспективными кандидатами для дальнейших функциональных исследований и селекционных программ (Huang et al., 2017).

Ограничения исследования

• Отсутствие аннотирования: Без аннотирования транскриптов сложно определить их биологическую функцию.
• Отсутствие дифференциального анализа: Не были выявлены гены с измененной экспрессией между разными условиями.

Перспективы дальнейших исследований

• Аннотирование транскриптома: Использование инструментов, таких как BLAST и InterProScan, для функциональной аннотации транскриптов (Jones et al., 2014).
• Дифференциальный анализ экспрессии: Применение методов статистического анализа для выявления генов с измененной экспрессией между образцами (Love et al., 2014).

Заключение

В данной работе был подробно описан процесс квантификации транскриптома картофеля с использованием современных биоинформатических инструментов. Квантификация служит важным промежуточным этапом между сборкой транскриптома и последующими анализами, обеспечивая критически важную информацию о уровнях экспрессии генов. Полученные результаты создают основу для дальнейших исследований, направленных на понимание генетической регуляции и улучшение культурных свойств картофеля.

Приложения

Приложение A: Таблицы топ-10 транскриптов для каждого образца

Топ-10 транскриптов для plant1_rep1:

Топ-10 транскриптов для plant1_rep2:

Топ-10 транскриптов для plant1_rep3:

Топ-10 транскриптов для plant2_rep1:

Топ-10 транскриптов для plant2_rep2:

Топ-10 транскриптов для plant2_rep3:

Топ-10 транскриптов для plant3_rep1:

Топ-10 транскриптов для plant3_rep2:

Топ-10 транскриптов для plant3_rep3:

Топ-10 транскриптов для reference_rep1:

Топ-10 транскриптов для reference_rep2:

Топ-10 транскриптов для reference_rep3: