Биотрансформация растительного экстракта с помощью Glomerella fusarioides

Biotransformation of plant extract with Glomerella fusarioides

Yerbol Ikhsanov

PhD student, Al-Farabi Kazakh National University, Kazakhstan, Almaty

Iqbal Mohammed

Doctor of Science, Professor, Director of International Center for Chemical and Biological Sciences, Karachi University, Pakistan, Karachi

Nurgul Sultanova

Doctor of Science, Assistant Professor Faculty of Chemistry and Chemical Technology, Al-Farabi Kazakh National University, Kazakhstan, Almaty

Zharylkasyn Abilov

Doctor of Science, Professor of department of organic chemistry natural compounds chemistry and polymers Faculty of Chemistry and Chemical Technology, Al-Farabi Kazakh National University, Kazakhstan, Almaty

Аннотация. В статье рассматривается химический состав 50 % спиртового экстракта из надземной части растения Tamarix hispida Wild семейства Tamaricaceae модифицированного с помощью грибков вида Glomerella fusarioides (ATCC 9552) и изученных методов высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектором. В результате отмечено значительное изменение химического состава экстракта, в частности обнаружено несколько азотосодержащих соединений, ранее не обнаруженных в семействе Tamaricaceae.

Abstract. The chemical composition of a 50 % alcohol extract from the aerial part of the Tamarix hispida Wild plant of the family Tamaricaceae modified with fungi of the species Glomerella fusarioides (ATCC 9552) and the methods of HPLC-MS. As a result, a significant change in the chemical composition of the extract was noted, in particular, several nitrogen-containing compounds, previously not found in the Tamaricaceae family, were detected.

Ключевые слова: Tamarix hispida Wild; Glomerella fusarioides; биокатализ.

Keywords: Tamarix hispida Wild; Glomerella fusarioides; Biocatalysis.

Введение. В природе существует множество мест способных быть источником новых, перспективных видов микроорганизмов способных вырабатывать ферменты для биокатализа [1, с. 918].

Грибы традиционно были одной из наиболее изученных систем для выделения микробных метаболитов, а также для реакций биотрансформации. Выделение грибов из окружающей среды вызвало интерес исследователей, поскольку было установлено, что только очень немногие существующие виды грибов изучены в полной мере [2, с. 12027].

Воздействие грибов на объект происходит путем естественного заражения и дальнейшего развития колоний грибов в окружающей среде, обеспечивающей благоприятные условия (наличие питательной среды, температурный режим и влажность) [3, с. 604].

Под воздействием веществ, выделяемых колониями микро­организмов возможно протекание множества химических процессов, наибольший интерес из которых представляют реакции гидроксили­рования, окисления, восстановления, сульфоксидирования, эпоксиди­рования, окисление линейных и циклических кетонов Байера-Виллигера, микробное стереоселективное биовосстановление или энантиоселек­тивный гидролиз [4, с. 41].

В нашей статье мы рассматриваем применение метода биотранс­формации к экстракту, полученному из надземной части растения Tamarix hispida с целью повышения его биологической активности.

Растение Tamarix hispida Willd. характеризуется разнообразием состава природных биологически активных веществ, обладающих широким спектром биологического действия в том числе антимикробной, противогрибковой активностью, есть информация о применении экстрактов тамарикса при таких заболеваниях, как сифилис и бесплодие, растение используются в традиционной медицине как вяжущее, мочегонное средство [5, с. 278; 6, с. 1928]. Кроме того, в нескольких исследованиях доказана антиоксидантная и антимикробная активность некоторых видов Tamarix.

В качестве модифицирующего грибка нами выбран грибок вида Glomerella fusarioides (ATCC 9552) промотирующий преимущественно реакции окисления, алкилирования и замещения [7, с. 616].

Методика. На начальном этапе нами был получен 50 % этанольный экстракт из надземной части растения Tamarix hispida Willd по следующей методике: 500 г надземной части растения вида Tamarix hispida залили 10 л растворителя и проводили экстракцию при комнатной температуре в течении 72 часов, полученное извлечение затем сконцентрировали на ротационном испарителе и высушили до полного удаления растворителя при температуре, не превышающей 40 ºС.

Параллельно нами была подготовлена реакционная среда, содержащая в себе достаточно развитую колонию грибков Glomerella fusarioides. Для чего в заранее приготовленную питательную среду были инокулированы споры Glomerella fusarioides и оставлены на качалке при температуре 25 ºС на 72 часа. Затем, в колбы с колонией грибков и питательной средой вносится растворённый в стерильной воде экстракт Tamarix hispida, после чего колба ставиться на качалку.

С целью определения влияния срока выдержки на химический состав нами было подготовлено две пробы оставленные на 7 и 14 суток.

Далее растворы были отделены от грибков методом фильтрования, после чего фильтрат был проэкстрагирован бутанолом в делительной воронке. Полученные водная и бутанольная фракции были высушены методом лиофилизации.

Полученный экстракт исследовали методом высокоэффективном жидкостном хроматографе с масс-селективным детектором Aligent Technologies 6400 Series Triple Quadrupole LC/MS при следующих условиях: использовали колонку Poroshell 120 EC-C18 (длинна – 50 мм, диаметр 3 мм, размер частиц сорбента 4,0; 2,7 и 1,9 мкм), с 10 % водным раствором метанола в качестве исходного растворителя и 90 % мета­нолом в качестве конечного растворителя при давлении 11,5 мПа и температуре 40 ºС. Компоненты идентифицировали по масс-спектрам и временам удерживания, с использованием библиотеки NIST и Wiley LC/MS.

Также было проведено определение противораковой активности экстрактов по следующей методике. Модифицированные клеточные линии MCF-7 после слияния клетки собирали и плакировали в 96‑луночных планшетах с обработанной культурой ткани (плотность посева 8000 клеток / лунка для MCF-7 в среде с 100 мкл). На следующем этапе в лунки добавляется испытуемое вещество при концентрации 50 мкМ и проводится инкубирование в течение 48 часов. Для натуральных экстрактов концентрация составляла 50 мкг / мл.

После 48 часов инкубации соединения удаляли и в каждую лунку добавляли 200 мкл МТТ при 0,5 мг / мл и инкубировали при 37 ° С в течение 3 часов.

Кристаллы формазана, образованные путем восстановления MTT, растворяли в 100 мкл ДМСО и поглощение брали при 570 нм с использованием микропластинчатого считывателя (Spectra Max plus, Molecular Devices, CA, USA) [8, с. 4827].

Результаты и обсуждение. В результате нами был получен химический состав 4 образцов, из них – 2 водные фракции 7 и 14 суток выдержки, и 2 аналогичные бутанольные фракции.

В первом образце, бутанольной фракций семидневной выдержки нами было идентифицировано 5 соединений, доминирующими из которых являются гамабуфоталин и уксусной кислоты, 1,1 ', 4'-триа­цетокси-5,5'-диизопропил-6,7,6', 7'-тетраметокси-3,3'-диметил- [2,2 '] бинафталин-4-ил эфир (Таблица 1).

Таблица 1.

Химический состав бутанольной фракций экстракта Tamarix hispida после 7 суток

Образец с 14 дневной выдержкой имеет в целом аналогичный химический состав, также доминирующим соединениями являются гама­буфоталин и уксусной кислоты, 1,1 ', 4'-триацетокси-5,5'-диизопропил-6,7,6', 7'-тетраметокси-3,3'-диметил- [2,2 '] бинафталин-4-ил эфир также обнаружено некоторое количество Церкоспорина (Таблица 2).

Таблица 2.

Химический состав бутанольной фракции экстракта Tamarix hispida после 14 суток

Химический состав водных фракций, как видно из данных представленных в таблице 3, значительно отличается от бутанольного, доминированием полярных азото и серосодержащих соединений в частности (6-оксо-1-фенил-1,6-дигидропиридазин-3-илокси) уксусной кислоты, этиловым эфиром содержащимся в количестве 44,29 % однако в заначительном количестве идентифицированы и менее полярные вещества такие как 5 β; -Чолан-24-ова кислота, 4- (23-карбокси-7,12-диоксо-24-нор-5 β; -хлор-3-ен-3-ил) -3,7,12-триоксо-, диметиловый эфир.

В водной фракции образца четырнадцатидневной выдержки доминирующими веществами являются 2-пропеновой кислоты,
3-фенилпропиловый эфир, 5 β; -Чолан-24-ова кислота, 4- (23-карбокси-7,12-диоксо-24-нор-5 β; -хлор-3-ен-3-ил) -3,7,12-триоксо-, диметиловый эфир, Холестан-26-овая кислота, 3,7,12-тригидрокси-, (3α, 5β, 7α, 12α) и Хиноксалин, 2,3-дифенил что в целом согласуется с тенденцией, выявленной в семидневной водной фракций (Таблица 4).

Таблица 3.

Химический состав водной фракции экстракта Tamarix hispida после 7 суток

В дальнейшем, так как в составе бутанольных экстрактов было обнаружен гамабуфоталин обладающий противоопухолевой актив­ностью, нами было принято решение проверить образцы на этот тип активности. Полученные данные представлены в таблице 5.

Таблица 4.

Химический состав водной фракции экстракта Tamarix hispida после 14 суток

Таблица 5.

Противоопухолевая активность

Из представленных данных мы видим, что наибольшую активность проявляет образец номер 2, то есть бутанольная фракция экстракта тамарикса после 14 суток, однако, при этом, наибольший рост активности, более чем в 20 раз, отмечен в водных фракциях.

Выводы. Нами изучен химический состав 4 образцов водных и бутанольных фракций модифицированнного экстракта. Установлено, что наибольший рост активности отмечается в водных фракциях, однако в абсолютных значения выделяется бутанольная. Исходя из этого можно предположить, что в неразделённом состояний экстракт после трансформации потенциально может демонстрировать активность более 70 %, однако этот вопрос требует более подробного изучения.

Тем не менее, нами получен результат демонстрирующий значи­тельный рост биологической активности в следствий воздействия грибков вида Glomerella fusarioides на 50 % этанольный экстракт из надземной части Tamarix hispida.