Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов у пациентов с нарушением фертильности

Evaluation of sperm DNA fragmentation in couples using ART

Lyubov Postnikova

Master of Science, Saint-Petersburg state University, Russia, Saint-Petersburg

Vera Kuzmina

Biologist, «AVA-PETER» clinic, Russia, Saint-Petersburg

Galina Ushakova

Biologist, «AVA-PETER» clinic, Russia, Saint-Petersburg

Elena Fedorova

PhD, head of the Laboratory of Genetics, «AVA-PETER» clinic, Russia, Saint-Petersburg

Аннотация. В современном мире для борьбы с бесплодием активно применяется метод экстракорпорального оплодотворения. Для оценки вероятности наступления беременности проводят ряд тестов, позволяющих оценить состояние мужских половых клеток. Перспектив­ным направлением исследований представляется разработка методов, которые позволят повысить точность оценки мужской фертильности. Одним из таких методов является оценка фрагментации ДНК сперма­тозоидов в эякуляте. Цель нашей работы заключается в проведении сравнительного анализа содержания сперматозоидов с фрагменти­рованной ДНК у здоровых мужчин и у мужчин с нарушением фертильности.

Abstract. In vitro fertilization is a method widely used for infertility treatment nowadays. Variety of tests is required to estimate the functionality of male sperm cells and the fertilization probability. One such method is the evaluation of sperm DNA fragmentation rate in the ejaculate. The purpose of our work is to perform a comparative analysis of the content of spermatozoa with fragmented DNA in healthy men and in men with impaired fertility.

Ключевые слова: фрагментация ДНК сперматозоидов; мужское бесплодие; экстракорпоральное оплодотворение.

Keywords: sperm DNA fragmentation; male infertility; in vitro fertilization.

Введение. Экстракорпоральное оплодотворение сегодня является широко распространенным методом, используемым при лечении беспло­дия, вызванного различными причинами, в частности, нарушением репродуктивных функций мужчины. Неудача оплодотворения может быть следствием разнообразных факторов, которые обусловлены нали­чием структурных и физиологических особенностей мужских половых клеток. В этой связи предсказание возможности беременности требует наличия целого ряда тестов, способных учесть указанные особенности. Традиционный клинический метод для диагностирования нарушений, возникающих при сперматогенезе – метод анализа спермограммы, в рамках которого оцениваются такие параметры, как концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов [8, с. 2163; 10, с. 186]. Однако стандартные показатели спермограммы не во всех случаях с достаточной точностью позволяют оценить вероятность успешного экстракорпорального оплодотворения. В то же время бесплодие в подобных ситуациях может быть обусловлено наличием нарушений в генетическом материале сперматозоидов, и в силу того, что структура хроматина может быть аномальной, возможно возникновение пре­пятствий для развития эмбриона.

Сегодня имеется распространенное мнение, согласно которому оценка мужской фертильности с помощью традиционного лабораторного исследования морфологии, концентрации и подвижности (спермограмма) должна быть дополнена анализом состояния ДНК в сперматозоидах. Широкое распространение получил метод TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick-end Labelling) Br-dUTP Br-dUTP. При его использовании мечение разрывов в ДНК осущест­вляют с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT). Этот фермент распознает разрывы и катализирует присоединение Br‑dUTP (бром-дезоксиуридинтрифосфата) в места разрывов к 3’ – концу. Br-dUTP визуализируют с помощью антител к Br-dUTP, конъюгиро­ванных с флуорохромом [12, с. 93-97].Еще один базовый метод SCSA (sperm chromatin structure assay) основан на метахроматических свойствах акридина оранжевого, различным образом флюоресцирующего при связывании с однонитевыми (флуоресцирует красным) либо двунитевыми (флуоресцирует зеленым) ДНК.

Результаты и обсуждение. Мы оценили долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК у 327 пациентов методами TUNEL и с помощью окраски акридиновым оранжевым (Рис. 1). Для каждого пациента было проанализировано не менее 2000 сперматозоидов. На основании параметров спермограммы выделили 5 групп: нормозоо­спермия, астенозооспермия, тератозооспермия, олигоастенозооспермия и олигоастенотератозооспермия. Критерии определения нормы для доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК сильно варьирует между разными лабораториями: 15 % [2, с. 1026]; 30 % [4, с. 177]. В связи с этим, на основании литературных данных и собственных наблюдений, пациентов разделили на три группы в зависимости от доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК: <15 % – норма, 15 %-30 % – пограничное значение и >30 % – патология.

Примечание: А – Окрашивание акридиновым оранжевым. Ядра сперма­тозоидов с фрагментированной ДНК имеют желто-оранжевую и оранжевую флуоресценцию; ядра с неповрежденной ДНК флуоресцируют в зеленой и желтой областях спектра. Б – Выявление фрагментации ДНК в сперматозоидах методом TUNEL. Ядра сперматозоидов с поврежденной ДНК флуоресцируют в красной области спектра; ядра сперматозоидов с неповрежденной ДНК (окрашены DAPI) – синяя флуоресценция. Масштабная линейка 5 мкм.

Рисунок 1. Сперматозоиды из эякулята человека (увеличение 60х).

На рис. 2 представлены данные для доноров спермы и пациентов с нормозооспермией, астенозооспермией, тератозооспермией, олиго­астенозооспермией (ОА) и олигоастенотератозооспермией (ОАТ). Для пациентов каждой группы была подсчитана доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК. Как видно на Рис. 2, даже среди пациентов с нормозооспермией имеется достаточное количество мужчин с высокой долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК.

Рисунок 2. Распределение числа пациентов в каждой группе, имеющих долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК меньше 15 %, от 15 % до 30 % и более 30 %

По данным литературы, более чем у 11 % мужчин с нормозооспер­мией выявляют значительную (более 20 %) долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК [9, с. 147; 1, с. 1589]. Как видно из графика (Рис. 3А), в группе доноров 100 % участников укладываются в интервал, соответствующей доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК менее 30 %, а у пациентов с нормозооспермией 20 % наблюдаемых значений оказывается в интервале, соответствующем доле сперма­тозоидов с фрагментированной ДНК более 30 %. Из графика (Рис. 3Б) также видно, что большая часть сперматозоидов у пациентов с нормо­зооспермией содержит нефрагментированную ДНК, также видно, что распределение не Гауссово, поэтому для сравнения доноров спермы с пациентами с нормозооспермией был применен непараметрический критерий рассеяния Колмогорова-Смирнова, который выявил статисти­чески значимые отличия между этими группами (K-S= 2,5; P = 0,000007).

Рисунок 3. А. Распределение пациентов с нормозооспермией по накопленной частоте сперматозоидов с фрагментированной ДНК (синяя линия – доноры, N=26; красная линия -пациенты с нормозооспермией, N=105). Б. Распределение пациентов с нормозооспермией по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК

Для всех остальных групп были обнаружены сходные зависимости. Группы пациентов с астенозооспермией, олигоастенозооспермией и олигоастенотератозооспермией статистически значимо отличаются от доноров спермы (кроме пациентов с тератозооспермией (K-S = 1,2;
P = 0,1)): пациенты с астенозооспермией K-S = 2,1; P = 0,0003; с олиго­астенозооспермией, K-S = 1,8; P = 0,002; с олигоастенотератозооспермией K-S = 1,5; P = 0,02.

Предположение о корреляции между морфологическими пара­метрами сперматозоидов и фрагментацией ДНК было выдвинуто на основании данных о том, что важная роль апоптоза состоит в устранении дефектных клеток: ДНК разрушается в аномальных сперматозоидах, по аналогии с различными соматическими клетками [11, с. 534]. По данным [5, с. 837], фрагментация ДНК вследствие апоптоза ниже в группе пациентов с нормозооспермией и у доноров спермы по сравнению с группами пациентов с астенозооспермией, олигоасте­нозооспермией и олигоастенотератозооспермией.

Апоптоз является конечным результатом различных патологических состояний и системой деградации, контролирующей сперматогенез.

При диагнозе «тератозооспермия» у пациента в эякуляте присутствует значительное количество сперматозоидов с аномальной морфологией, в том числе с вакуолизированной головкой.

Берковитс предположил, что наличие вакуолей в головке сперма­тозоида коррелирует с фрагментацией ДНК этого сперматозоида [3, с. 637]. В нашем исследовании у пациентов с тератозооспермией также была выявлена высокая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК: 80 % и 90 %. Однако малочисленность данной выборки не позволила показать статистически значимые отличия от доноров спермы (K-S = 1,2; P = 0,1). При этом, в ряде исследований показано, что увеличение доли сперматозоидов с поврежденной ДНК в эякуляте бесплодных мужчин коррелирует с аномальными параметрами спермограммы [6, с. 136; 7, с. 385].

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что при снижении основных параметров спермиологического анализа наблюдается увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК.