Активность окислительно-восстановительных ферментов у Colchicum Speciosum и C. Autumnale

Activity of redox enzymes from Colchicum Speciosum and C. Autumnale

Natallia Gribok

researcher, Central Botanical Garden of NAS of Belarus, Belarus, Minsk

Аннотация. Представлены результаты определения активности полифенолоксидазы и пероксидазы в органах C. speciosum и С. autumnale на различных фазах их сезонного развития. Установлено, что на уровень активности ферментов достоверно влияют такие факторы как фаза вегетации, видо- и органоспецифичность накопления, а также фактор года, который отражает возрастные изменения клонов и метеорологи­ческие условия периода вегетации в годы полевых наблюдений.

Abstract. The results of determining the activity of polyphenoloxidase and peroxidase in organs of C. speciosum and C. autumnale at different phases of their seasonal development are presented. It was found that the level of enzyme activity is significantly influenced by such factors as the phase of vegetation, species and organospecific accumulation, as well as the factor of the year, which reflects the age - related changes in clones and meteorological conditions of the growing season in the years of field observations.

Ключевые слова: Colchicum Steven и C. autumnale L.; полифенолоксидаза; пероксидаза; факторы.

Keywords: Colchicum Steven and C. autumnale L.; polyphenol oxidase; peroxidase; factors.

Введение. В осуществлении глубокого окислительного превра­щения широкого спектра фенольных соединений (ФС) первостепенная роль принадлежит полифенолоксидазе (ПФО) и пероксидазе (ПО) высших растений [1; 2]. Известно, что изменения активностей ПО, ПФО соответствуют изменению уровня ФС в растении [3; 4]. Определение активностей ПФО и ПО в органах C. speciosum и С. autumnale представляет интерес в связи с изучением особенностей вторичного метаболизма данных видов в условиях Беларуси.

Цель исследования. Целью исследования является определить факторы и доли их влияния на накопление вторичных метаболитов (ВМ) C. speciosum Steven и C.autumnale L. При культивировании в условиях Беларуси.

Материалы и методы. В качестве объектов исследования использованы видообразцы C. speciosum Steven и C.autumnale L. из коллекции эфемероидных растений лаборатории интродукции и селекции орнаментальных растений ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси». Статистическая обработка результатов проведена с использованием прикладных программ Statistica 6.0, Excel 2013.

Результаты и их обсуждение. В рамках настоящей работы впервые определены активности ПФО и ПО в органах C. speciosum и С. autumnale на различных фазах их сезонного развития (таблица 1).

Активность ПФО в органах изучаемых видов изменяется на протяжении вегетационного сезона в годы полевых наблюдений. В начале отрастания для клубнелуковиц C. speciosum характерна низкая активность ПФО, затем активность фермента постепенно возрастает и в конце фазы плодоношения может достигать максимальных за сезон значений (2-й год культивирования) или максимум приходится на фазу цветения (1-й и 3-й годы культивирования) (см. таблицу 1), что можно считать критерием метаболической активности.

Таблица 1.

Оксидазная активность в отдельных органах C. spesiosum (а) и C. autumnale (б) на разных фазах развития, отн. ед./ (г х сек)

В первом случае повышение активности ПФО сопровождается понижением содержания ФС и колхицина и повышением содержания колхамина (содержание ФС, колхицина и колхамина определены ранее [5; 6]). Во втором случае отмечено резкое повышение содержания колхамина, существенное повышение содержания колхицина и ФКК, некоторое снижение содержание антоциновых соединений.

Активность ПФО у С. autumnale, как правило, выше, чем у первого вида. Активность ПФО в клубнелуковицах С. autumnale, как правило, низкая в начале отрастания, при отмирании надземной части растения повышается. При этом в клубнелуковицах наблюдается повышение содержания колхамина, антоциановых соединений и ДВ. В фазе бутонизации и, особенно, в фазе цветения в клубнелуковицах С. autumnale наблюдается наиболее высокая за сезон активность данного фермента (см. таблицу 1) и повышение содержания колхицина и антоциановых соединений, а также снижение содержания ФКК и ДВ.

Для надземных органов изучаемых видов характерна более высокая активность ПФО, чем для клубнелуковиц. В течение вегетации отмечено два пика активности ПФО в надземных органах C. speciosum. Первый пик активности данного фермента наблюдается в начале отрастания в молодых листьях, когда в клубнелуковицах наблюдается повышение содержания колхамина, флавонов, ФКК и ДВ. Второй всплеск активности ПФО отмечен после окончания периода летнего покоя в бутонах или в цветках (см. таблицу 1), когда в них наблюдается повышение содержания колхицина, флавонов и ФКК.

Для надземных органов С. autumnale максимальная активность ПФО в годы полевых наблюдений приходится на фазу бутонизации (см. таблицу 1), когда также отмечается повышение содержания колхицина, антоциановых соединений, катехинов, флавонов, ФКК и ДВ.

Изучение активности ПО показало, что наибольшая активность этого фермента в клубнелуковицах обоих видов отмечена при отмирании надземных органов в конце плодоношения (см. таблицу 1), когда изменяется содержание колхицина и колхамина, а также ФС.

Наибольшую активность ПО проявляет в надземных органах изучаемых видов. Повышение активности ПО в надземных органах происходит в начале вегетационного периода (фенофазы I–II), а в фазе бутонизации наблюдается сезонный максимум активности этого фермента. Первому повышению активности ПО соответствует резкое снижение содержания колхамина, изменения содержания колхицина, антоциановых соединений и флавонов. Второму повышению активности фермента также соответствует резкое снижение содержания колхамина, изменения содержания колхицина, антоциановых соединений, флавонов и ФКК.

На основе изучения динамики полифенолоксидазной и перокси­дазной активностей по фазам вегетации C. speciosum и C. autumnale показано, что максимальная их активность наблюдается в фазах бутони­зации и цветения и приурочена к генеративным органам, которым присуща высокая метаболическая активность, что согласуется с литературными данными [1; 3; 4].

Показано, что изменениям активностей ПО, ПФО соответствуют изменения уровня накоплениям ВМ в растении, что согласуется с литературными данными [1; 3; 4].

Факторы, влияющие на активность полифенолоксидазы и пероксидазы. Выделены четыре фактора, которые оказывают влияние на накопление ВМ (колхицин, колхамин, антоцианы, катехины, флавоны, ФКК, ДВ) в процессе эксперимента: фаза развития (I–V), вид растения (C. speciosum и C. autumnale), орган (клубнелуковицы, надземные органы), год (1-й – 3-й годы культивирования). Проведен четырехфакторный дисперсионный анализ влияния этих факторов на активность ПФО и ПО. Обобщенные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Достоверность влияния изученных факторов (критерии Фишера) дисперсионного анализа на активность окислительно-восстановительных ферментов

Влияние факторов на активность ферментов иллюстрирует рисунок 1.

Рисунок 1. Влияние факторов на активность ферментов

Установлено, что все анализируемые факторы достоверно влияют на уровень активности окислительно-восстановительных ферментов (ПФО и ПО). Однако доли влияния факторов и их взаимодействий в изменчивости активности фермента различаются.

Наиболее существенное влияние на активность этих ферментов оказывает фактор фазы и фактор органа, а также взаимодействие этих факторов. Однако, существуют индивидуальные особенности измен­чивости активности ферментов.

На активность ПФО наиболее сильное влияние оказывает фактор фазы вегетации (30,29%), что свидетельствует о том, что активность данного существенно изменяется в течение вегетационного периода. Кроме того, на активность ПФО существенное влияние оказывают взаимодействия факторов фазы и органов (24,06 %), а также фазы и года (12,37 %), то есть активность ПФО в надземных органах и клубнелуковицах существенно различается и изменяется по фазам вегетации, а также годам наблюдения. В меньшей степени на активность ПФО влияет фактор вида (5,28 %).

На активность ПО наибольшее влияние оказывают фактор органа (16,54 %) и фактор фазы (10,29 %), а также взаимодействие этих факторов (27,41 %), то есть для активности ПО характерны органоспецифичность и изменения в течение вегетационного периода. Кроме того, на актив­ность ПО существенное влияние оказывает взаимодействие факторов фазы и вида (9,40 %), факторов фазы, вида и органа (9,84 %), а также факторов вида и органа (5,94 %), а значит, изменчивость активности данного фермента органах изучаемых растений на протяжении вегетационного периода носит видоспецифичный характер.

Корреляционный анализ влияния оксидазных ферментов на содержание вторичных метаболитов. Для анализа влияния окислительно-восстановительных ферментов на содержание ВМ у C. speciosum и С. autumnale рассчитаны соответствующие коэффициенты корреляции. Результаты анализа корреляционных связей активностей ферментов (ПФО и ПО) и содержания различных групп ВМ в органах изучаемых видов представлены в таблице 3

Таблица 3.

Корреляционные связи между активностью окислительно-восстановительных ферментов и содержанием различных ВМ

Проведенный анализ позволил выявить достоверную корреляцион­ную связь между активностью ферментов и содержанием ВМ органах C. speciosum и С. autumnale. Выявлены положительные корреляционные связи между активностью ПФО и содержанием колхицина (R=0,60), активностью ПФО и колхамина (R=0,22), а также активностью ПО и содержанием колхицина (R=0,44) у изучаемых видов. Существование таких связей между активностью окислительно-восстановительных ферментов и содержанием колхициновых алкалоидов в органах изучаемых видов растений может указывать на участие ПФО и ПО в метаболизме данных алкалоидов. Это согласуется с литературными сведениями о корреляции между активностью ПФО и содержанием других алкалоидов [7], а также о участии ПО в ключевых стадиях биосинтеза алкалоидов [8].

Положительные корреляции установлены между активностями ППО и ПО и содержанием ФС. Установлено, что между активностью ПО и содержанием флавонов существует значительная корреляционная связь (R=0,59). Между активностью ПФО и содержанием флавонов выявлена средняя корреляционная связь (R=0,45). Показана средняя теснота корреляционной связи между активностями ПФО и ПО и содержанием ФКК у изучаемых видов (R=0,32 и R=0,30 соответственно). Слабая теснота корреляционной связи выявлена между активностью ферментов и содержанием антоцианов и катехинов (R от 0,17 до 0,26). Теснота корреляционной связи, по-видимому, отражает характер субстратной специфичности данных ферментов.

Средняя положительная корреляционная связь установлена между активностью ПО и содержанием ДВ (R=0,34), что может служить подтверждением участия ПО в образование ДВ, что вполне согласуется с литературными данными [9, с. 157].

Заключение

На уровень активности окислительно-восстановительных фер­ментов достоверно влияют такие факторы как фаза вегетации, видо- и органоспецифичность накопления, а также фактор года, который отражает возрастные изменения клонов безвременников и метеоро­логические условия периода вегетации в годы полевых наблюдений. Наиболее существенное влияние на активность ПФО и ПО, как и на накопление ВМ, оказывают фактор фазы и фактор органа, а также взаимодействие этих факторов, то есть активность ферментов существенно различается в надземных органах и клубнелуковицах и изменяется в течение вегетационного периода.

Кроме того, выявлены положительные корреляционные связи между активностью ПФО и содержанием колхицина, колхамина и ФС (антоциановых соединений, катехинов, флавонов и ФКК), а также положительные корреляционные связи между активностью ПО и содержанием колхицина и ФС, что может свидетельствовать об участии данных ферментов в метаболизме колхициновых алкалоидов, а также подтверждает роль ППО и ПО в метаболизме ФС.