Изменение динамики фокальных контактов при нарушении цитоскелета клетки

Фокальные контакты (FA) - это динамические многокомпонентные белковые комплексы, которые служат точками интеграции как для механической, так и для химической сигнализации, играют центральную роль в различных процессах, включая метастазы в рак, атеросклероз и заживление ран [1,2,3 ]. Характеристика того, как эти структуры динамически меняются, имеет важное значение для понимания миграции клеток, которая требует, чтобы контакты непрерывно реконструировались по мере продвижения клетки. Во время подвижности на передней кромке выступающих ламеллиподий рождаются новые контакты. Затем они расширяются и либо разбираются в основании выступов в процессе, известном, как оборот сцепления, либо становятся более долгоживущими структурами, которые в конечном итоге демонтируются в убирающемся хвосте в задней части клетки [4,5,6]. В этом цикле, а также в других ФК - опосредованные процессы, динамика ФК сильно регулируются структурными и сигнальными молекулами [7,8,9]. Изменения в балансе этих регулирующих факторов играют ключевую роль в обороте адгезии и, таким образом, в сигнализации сцепления и нормальной функции клеток. Микроскопическая визуализация ФК-ов лежит в основе значительной части нашего текущего понимания динамики адгезии с помощью таких методов, как широкополосная флуоресцентная микроскопия, обеспечивающая изображения с высоким разрешением, подходящие для количественного анализа [10]. Однако проблемы, связанные с захватом изображений и анализом нисходящего потока, как правило, приводили к характеристике лишь относительно небольшого количества захваченных вручную контактов в любой данной клетке [7,8,11,12,13]. В частности, в этом исследовании мы используем нашу систему анализа изображений, чтобы охарактеризовать ФК, помеченные талин, создавая массивы данных с высоким разрешением распределения адгезии. Используется система для обнаружения изменений пространственно-временных свойств адгезии в ответ на мутацию А549 на талин. Посредством этого анализа мы показываем, что потеря этого единственного сайта фосфорилирования влияет на формирование адгезионного сайта, размер и скорость сборки. Также система анализа станет доступной по лицензии с открытым исходным кодом, чтобы позволить сообществу использовать наши методы для анализа новых экспериментальных систем. Эти результаты иллюстрируют преимущества автоматизированной крупномасштабной характеристики адгезионных свойств и поведения, позволяя легко обнаружить как большие, так и тонкие различия.

Были исследованы фокальные контакты (ФК) в клетках А549, растущих в нормальных условиях и при воздействии таксола и нокодазола в микромолярных концентрациях. В этих клетках ФК распределены между периферией и внутренней частью клетки. Использовалась широкопольная флуоресцентная микроскопия на микроскопе Carl Zeiss Cell Observer с инкубатором с камерой Hamamatsu CMOS ORCA FLASH 2 с использованием объектива x40 / 1.3 PlanApo. Эти эксперименты проводили с временным разрешением 5 мин. Эквивалентный размер пикселя при визуализации с объективом x40/1.3 составлял 0,168 мкм. Запись изображений осуществлялось со следующими параметрами микроскопии: экспозиция 300 мкс для флуоресценции в канале Rhodamin и канале DIC в течение 24 часов. 16-и битные изображения обрабатывали в программе ImageJ для подавления шумов и увеличения контраста (размытие по Гауссу, изменение параметров яркость-контраст, вычитание фона). Обработку и дальнейший анализ полученных фильмов проводили в программе ImageJ (NIH Image, США). Динамическое поведение ФК из разных областей клетки, исследовалось на полученных для каждой клетки последовательностях изображений. Положение ФК отслеживали вручную с помощью курсора в плагине ROImanager, позволяющем отслеживать изменение координат области ФК в зависимости от времени. Изменение яркости растущих ФК измеряли как различие между областью содержащей контакт и соседней областью, не содержащей контакта в зависимости от времени.  

Вычислялась максимальная интегральная яркость ФК (A.U.), время жизни ФК (мин), скорость сборки и скорость разборки ФК. Общее количество исследованных ФК в контрольных клетках составило 200. Из них 96 составили внутренние и 104 внешние контакты. Максимальная интенсивность яркости во внутренних контактах составила: средняя величина (mean)= 141,9*10⁴ A.U, стандартное отклонение (SD)= 144,1*10⁴A.U. Максимальная интенсивность яркости во внешних контактах: средняя величина (mean)= 133,9*10⁴ A.U, стандартное отклонение (SD) =19*  A.U. Время жизни внутренних контактов составило: средняя величина (mean) =151,3 мин, стандартное отклонение (SD) = 75,3 мин. Время жизни внешних контактов значительно меньше: средняя величина (mean) = 64,2 мин, стандартное отклонение (SD)= 22,9 мин. На кривых изменения интегральной яркости во времени для 96 образца ФК из внутренних областей в 57 прослеживаются фазы роста, в 58 – фазы разборки. В остальных ФК рост и разборка происходят с переменной скоростью и сопровождаются реверсиями. Для 104 ФК из внешних областей в большинстве случаев видны как фазы сборки (98), так и фазы разборки (86).

t-критерий Стьюдента использовался для определения статистической значимости различий средних величин яркости, времени жизни внутренних и внешних контактов различается достоверно. Так как рассчитанное значение критерия меньше критического, делаем вывод о том, что наблюдаемые различия статистически значимы (уровень значимости р<0,05). То есть по критерию Стьюдента данных допустимо считать, что ФК образовавшиеся на краю клетки обладают высокой яркостью, живут  коротко, то время как ФК во внутренней части относительно тусклее и обладают широким диапазоном времени жизни. Количество исследованных ФК в клетках, обработанных нокодазолом, равно 99. Из-за малого количества выборки все являются внешними. Максимальная интенсивность яркости контактов: стандартное отклонение (SD)=18*  A.U., среднее значение (mean)=3*  A.U.. Продолжительность жизни контактов: средняя величина (SD)=51,998 мин, среднее значение (mean)=140 мин. Видно 69 сборок, 66 разборок ФК из 99 образцов. Количество исследованных ФК в клетках, обработанных таксолом, составило 101. Все они располагались на краях клеток. ФК в глубине клеток встречались чрезвычайно редко. Максимальная интенсивность яркости контактов составила: стандартное отклонение (SD) = 12*  A.U., среднее значение (mean)= 26*  A.U. Продолжительность жизни контактов: стандартное отклонение (SD)= 64,1 мин, среднее значение (mean)= 120 мин.

Яркость контактов внутри клетки и на краю различается (р=0.002), время жизни различается в два с половиной раза (p<0.001). При воздействии нокодазола и таксола время жизни контактов не отличается от такового на краю контрольных клеток (p>0.05) и не различается между собой. Максимальная яркость контактов при воздействии нокодазола и таксола возрастает по сравнению с контролем статистически достоверно (p<0.001); различия между двумя воздействиями малодостоверны (p=0.034), хотя эффект нокодазола выражен несколько сильнее (301± 171 в таксоле и 357±252 в нокодазоле).

При направленной миграции фокальные контакты появляются главным образом на периферии клеток в областях активного разведения. Зарождающиеся фокальные контакты, образовавшиеся вблизи кромки клеток, либо исчезают, либо некоторые из них выживают более 1-2 мин и растут в зрелые фокальные контакты с повышенной яркостью. Зрелые  фокальные контакты  имеют ограниченный срок службы (в клетках A549 - 70,0 ± 55,1 мин, в клетках U-118 - 43,7 ± 38,3 мин). Фокальные контакты сначала растут до их максимального размера, затем стабильны в течение некоторого времени и, наконец, разбираются. Эти фазы аналогично выглядят в клетках A549 и U118. При наличии ингибиторов микротрубочек, когда подвижность клеток затруднена, фокусный адгезионный оборот (формирование и разборка) продолжается. Это значительно замедляется после лечения таксолом, в то время как реакция фокальной адгезии на лечение нокодазолом может быть специфичной для клеточного типа.