Оценка влияния генетического полиморфизма rs11675434 на уровень антител к тиреоидной пероксидазе.

Актуальность исследования: тиреоидная пероксидаза (ТПО) является ключевым ферментом в биосинтезе гормонов щитовидной железы.

Фермент относится к классу оксидоредуктаз, подклассу пероксидаз.

Катализирует ключевые реакции синтеза щитовидных гормонов: окисление йодида в более реакционноспособную форму, присоединение йода к тирозиновым остаткам тиреоглобулина и слияние йодотирозинов в синтезе тироксина и трийодтиронина.

ТПО рассматривают как один из основных аутоантигенов, который индуцирует синтез аутоантител в патогенезе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы (АЗЩЖ) в результате нарушения иммунологической толерантности. Синтезируемые антитела (АТ) относятся к классу Ig-G.

Особое значение АТ к ТПО в патогенезе АЗЩЖ придают в связи с их способностью к фиксации и активации по классическому пути комплемента, и таким образом способностью принимать непосредственное участие в лизисе тиреоцитов (Кандрор В.И. и др., 1997).

Определение титра АТ к ТПО – один из необходимых тестов для обнаружения АЗЩЖ. На фоне лечения патологии других органов некоторыми лекарственными препаратами высокий уровень АТ к ТПО может служить фактором риска для развития дисфункции щитовидной железы, включая развитие аутоиммунных осложнений (Martino E. et al., 2001; Ward D.L., Bing-You R.G., 2001; Johnston A.M., Eagles J.M., 1999).

Пациентки, в крови которых на ранних сроках беременности был обнаружен высокий титр АТ к ТПО, подвержены риску развития послеродового тиреоидита (Premawardhana L.D. et al., 2000).

Согласно литературным данным, синтез АТ к аутоантигенам щитовидной железы обусловлен генетическими факторами у 70% пациентов (Hansen P.S. et al., 2006). С помощью мета-анализа GWAS были отмечены следующие гены, влияющие на уровень АТ к ТПО: участок вблизи гена ТПО rs11675434, ген ATXN2 rs653178, ген BACH2 rs10944479.

Ранее исследователями было доказана ассоциация с высокой степенью достоверности (P <5*10-8) rs11675434 с наличием не только TPOAb-антител, но и с их высоким титром в сыворотке (Medici M. et al., 2014). Целью исследования являлось исследовать роль аллельного полиморфизма вблизи гена TPO (rs11675434) в развитии аутоиммунных заболеваний щитовидной железы у жителей Новосибирской области.

Материалы: в выборку были включены 139 пациентов (17 мужчин (12 %), 122 женщин (88 %), средний возраст которых составил 39,8 ± 14,4 лет), с различными функциональными состояниями щитовидной железы. Критериями, определяющими функциональное состояние щитовидной железы, являлись лабораторные показатели ТТГ (референсное значение 0,4-4,0 мЕд/л), Т4 свободный (9,0-19,05 пмоль/л), АТ к ТПО (<5,6 Ед/л). Явный гипотиреоз был определен у лиц с высоким показателем ТТГ и низким уровнем свободного Т4. Увеличение уровня ТТГ было определено так же у лиц с гипотиреозом или субклиническим гипотиреозом, у которых уровень свободного T4 был в пределах нормы. Явный гипертиреоз был определен по низкому показателю ТТГ и высокому уровню свободного T4. Снижение ТТГ определялось в том числе лиц с субклиническим или явным гипертиреозом. Для исследования полиморфного локуса rs11675434 вблизи гена TPO исследуемая группа была поделена на 2 подгруппы, критерием разделения был показатель АТ к ТПО. В подгруппу с наличием АТ к ТПО (АТ-ТПО+) были включены 55 человек (3 мужчин, 52 женщины, средний возраст которых составил 39,6±14,5 лет). В подгруппу с отсутствием АТ к ТПО (АТ-ТПО-) были включены 80 человек (14 мужчин, 66 женщин, средний возраст которых составил 39,8±14,4 лет). В контрольной группе в исследовании полиморфного локуса rs11675434 вблизи гена TPO были включены 95 здоровых человек без исследуемой патологии и лабораторными показателями в рамках нормы (7 мужчин и 88 женщин, средний возраст которых составил 30,7 ± 9,4 лет). Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН.

Методы: для выделения ДНК использовали метод фенол - хлороформной экстракции. Типирование полиморфного локуса rs11675434 вблизи гена TPO проводили методом ПЦР в режиме реального времени. Нуклеотидная структура олигонуклеотидных праймеров приведена в таблице1.

Таблица 1.

Структура олигонуклеотидных праймеров

Общий объём реакционной смеси составлял 20 мкл, смесь содержала 65 мМ Tris-НСl, 16 мМ (NH4)2SO4; 0,05% Tween 20; 3 мМ MgCl2., 0.2 мМ dNTP, 20-100 нг ДНК, 1 ед. акт. KlenТaq-ДНК-полимеразы и растворы олигонуклеотидных праймеров и зондов в следующих концентрациях: лимитирующий праймер – 0.1 мМ, избыточный праймер – 1 мМ и зонд – 0.1 мМ. Амплификация проводилась с помощью амплификатора LightCycler 96 (ROCHE, Швейцария) в следующих условиях: начальная денатурация 5 мин при 96°С; затем 49 циклов, включающих денатурацию при 96°С - 10 сек, отжиг праймеров и последующую элонгацию при 56°С - 30 сек, с последующим съемом флуоресценции и плавлением продуктов амплификации.

Для типирования полиморфного локуса вблизи гена TPO rs11675434 было необходимо отобрать контрольные образцы трех генотипов (C/C, C/T и T/T), нуклеотидная последовательность которых была проверена с помощью секвенирования по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI 3130XL Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США) с использованием набора Big dye 3.1. Секвенирование производилось в ЦКП «Геномика» (ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск). Нуклеотидные последовательности анализировались с помощью программного обеспечения ChromasPro.

Статистический анализ результатов исследования полиморфного локуса вблизи TPO проводился с использованием статистического критерия дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса с помощью программного обеспечения IBM SPSS Statistics. В этом случае и при использовании других критериев нулевую гипотезу отвергали при P≤0,05.

Результаты и их обсуждения: в результате секвенирования были получены секвенограммы для генотипов C/C, C/T и T/T и интерпретированы в программном обеспечении Chromas Pro (Рисунок 1), с помощью программы GenBank были найдены искомые мутации. Затем эти образцы использовались в качестве контрольных образцов в типировании с помощью ассиметричной ПЦР.

Рисунок 1. Секвенограммы образцов, выбранных в качестве контрольных образцов в типировании полиморфного локуса вблизи гена TPO rs11675434, аллели: А) С/С; Б) С/Т; В) Т/Т;

Было проведено типирование полиморфного локуса rs11675434 вблизи гена TPO методом ассиметричной ПЦР в режиме реального времени на контрольной выборке здоровых жителей Западно-Сибирского региона, а также больных с заболеванием щитовидной железы (Таблица 2). Результаты анализировали с использованием технологии High resolution Melting Analysis (HRMA) на приборе LightCycler 96 (ROCHE, Швейцария), исходя из анализа графиков кривых плавления. Основным параметром, учитываемым для каждой из реакций, было соотношение значений флюоресценции (RFU) в диапазонах эмиссии интеркалирующего красителя FAM.

При увеличении температуры двойная спираль ДНК диссоциирует с высвобождением красителя и снижением флюоресценции, таким образом, осуществляется плавление продукта. Процесс изменения флюоресценции находится в прямой зависимости от температуры плавления. В случае, если интенсивность флюоресценции преимущественно увеличивается в диапазоне температуры плавления 57-62°С, то образец является гомозиготным по аллелю, соответствующему зонду с данным красителем. При гетерозиготном генотипе интенсивность флюоресценции увеличивается в диапазоне 60-63°С. При гомозиготном варианте по протективному аллелю интенсивность флюоресценции увеличивается в диапазоне 62-66°С (рисунок 2).

Рисунок 2. Графики производных кривых плавления продуктов амплификации при типировании полиморфного локуса rs11675434 вблизи гена TPO

Результаты по частотам генотипов полиморфного локуса rs11675434 вблизи гена ТРО не соответствовали нормальному распределению (P <10^-3). Были получены следующие частоты встречаемости генотипов для исследуемой группы и контрольной группы, соответственно.

Данные представлены в таблице 2. Анализируя полученные данные, приведенные в таблице, можно прийти к заключению о том, что частоты генотипов в выборках различаются только для генотипов Т/Т и С/С.

Таблица 2.

Результаты типирования полиморфного локуса rs11675434 вблизи гена TPO на выборке исследуемой группы и здоровых жителей Новосибирской области

  Исследование ассоциации с наличием антител к тиреопероксидазе, и развитием АЗЩЖ, соответственно, с применением статистического критерия Краскела-Уоллиса не привело к достоверному результату: при сравнении частот встречаемости генотипов полиморфного локуса rs11675434 вблизи гена ТРО в сформированных подгруппах исследуемой (АТ-ТПО+ и АТ-ТПО-) и контрольной групп статистически достоверной разницы не было обнаружено (Р=0,68; Р=0,46, соответственно).

Результат нашего исследования не нашел подтверждения на выборке Новосибирской области – мы не нашли ассоциации полиморфного локуса rs11675434 с наличием АТ-ТПО и развитием АЗЩЖ, которую доказали зарубежные исследователи с высокой степенью достоверности (P <5*10^-8) на популяциях Соединенного Королевства Великобритании (Medici M. et al., 2014), и на популяции Хорватии (p = 0.041) (Luka Brčić et al., 2016).

Вероятной причиной расхождений результатов нашего исследования с результатом зарубежных исследователей может являться недостаточная мощность исследуемой выборки, а также отсутствие статистической достоверности во встречаемости анализируемых генотипов полиморфного локуса rs11675434 в исследуемой и контрольной группах.

Вывод: ассоциации с генотипом полиморфного локуса rs11675434 вблизи гена TPO с наличием АТ-ТПО на исследуемой выборке не найдено (р = 0,68; р = 0,46).