Аннотация. В статье выделили аспекты пресноводных и слабосоленых озерных нитрофицирующих бактерий, культивируемые на разных средах, в Курганской области.

Ключевые слова: аммонификаторы, нитрифицирующие бактерии, денитрификаторы, пресноводные озера, соленые озера, грамположительные, грамотрицательные микроорганизмы.

Актуальность: азотфиксирующие микроорганизмы, обитающие в водоемах, осуществляют часть замкнутого цикла основного биогенного элемента – азота, который задействован в потоке энергии в водной среде.

Водные экосистемы являются динамичным подразделениям, поэтому и озера участвуют в динамичных биосферных процессах (сукцессионных, флуктуациях, межсезонных) [1, с.9].

Изучение роли нитрифицирующих микроорганизмов и самого азотного обмена здесь – это важный показатель, влияющий на развитие планктона, как кормовой базы для целевых гидробионтов: рыбы, ракообразные и т.п.

Так как в Курганской области насчитывается более трех тысяч озер, следовательно, изучение роли азотфиксирующих бактерий, в том или ином водоеме, представляет собой важный момент гидробиологических исследований.

Материал для исследования собран на территории Курганской области. На изучаемой территории были выбраны участки, соответствующие разным условиям среды, водоемы: Половинное, Становое, Беломойное, Соленое, Суерское, Елошное, Снегирево, Голубые озера.

Проведена экскурсия на водоемы по Курганской области. Средняя температура воды 3-4 С°. Прозрачность воды 30-40 см видимости, в целом при проведении видеосъемки сложно не заметить хорошую интенсивность света в мутной воде через лед и снег. Это влияет на плотность и продуктивность водоема. Озера активно используются в промысловом рыболовстве. В ходе экскурсии была установлена флора и фауна в виде ракообразных, дафний и придонной растительности. Так как озера мелководные и не глубже 5-6 метров, то в них происходит интенсивное перемешивание водных масс. Содержание неорганических форм азота практически равномерно по всей толще воды.

Озера замкнутого типа, где глинисто-заиленое дно преобладает над песчаным. К пресноводным относятся озера от 0,01% минерализации до 0,3%. К слабосоленым относятся водоемы от 0,3% до 1% минерализации [3, с. 9]. Уровень солености определяли TDS-метром.

Таблица 1.

Характеристика водоемов

Фенотипическое разнообразие внутри экосистемы популяций представляет собой важную, но относительно неисследованную область биологического разнообразия водных экосистем. Одна из проблем изучения изменчивости на этом уровне заключается в следующем, что классические биохимические (пробирные) методы являются трудно применяемыми к отдельным видам внутри смешанных колоний.

Материалы и методы

На базе лаборатории КГУ мы выделяли микроорганизмы из стоячих водоемов стационарным методом их культивирования. С помощью электронного одноканального дозатора были взяты пробы воды поверхностного слоя, каждая в объеме 1мл.

 Для достижения максимального успешного результата использовали питательные среды различного состава, а также различные условия культивирования продуцента. С использованием элективных твердых питательных сред нитрифицирующие бактерии количественно учитывали на ГПС и питательном агаре с добавлением сульфат аммония. В качестве индикаторов использовались лакмусовые бумажки, так как их почернение указывает на процесс выделения аммиака. На появившиеся через 5-10 дней колонии наносят по капле реактива Грисса, с покраснением среды регистрировали образование нитритов из аммония [5, с. 9].

Контроль численности осуществляют стандартными методами учета: непосредственный подсчет клеток под микроскопом (метод Виноградского-Брида), определение количества микроорганизмов методом подсчета колоний (чашечный метод). Рост на МПБ является диагностическим методом морфологии. Микроскопировали с помощью микроскопа ЛОМО МИКМЕД-6, фото с помощью камеры MC-10(USB-3.0). К морфологическим признакам относили: форму бактерий, размеры колоний, окраску по Грамму. После окрашивания грамположительные бактерии проявляются в фиолетовом или синем цвете, а грамотрицательные – в красном [5, с. 9].

Результаты и их обсуждение

Визуально колонии проб микрофлоры озер Половинное, Становое, Беломойное и Соленое, между собой были сходны во всех чашках Петри, размер округлых колоний варьировался от 3 до 8 мм. После подсчета колоний выяснили следующее: пробы, находившиеся при комнатной температуре, имели большее количество колоний, но меньших в размере. При микроскопировании были отмечены бактерии различной морфологии: палочковидные, шарообразные и др [2, с. 9]. Окрашивание по Грамму на глюкозо-пептонной среде выявило преобладание грамположительных диплококков, с вкраплениями грамположительных палочек (Рис. 1).

Рисунок 1 Количество колоний выросших на ГПС

В повторном посеве микрофлоры на питательном агаре, с добавлением сульфат редуцирующего агента, культивировались мелко-зернистые колонии до 1мм. Они находились в тесном контакте друг с другом. Наблюдали общее преобладание грамположительных кокков, которые были размещены скоплениями разного размера и количества. Индикатор Грисса в микрофлоре воды озер Соленое и Беломойное, прореагировал красным окрашиванием, что связано с присутствием образовавшихся нитритов из аммония.

Рисунок 2 Количество колоний, выросших на питательном агаре с добавлением сульфат аммония

Микрофлора водоемов Суерское, Снегирево, Елошное и Голубых озер была высеяна на питательный агар с добавлением сульфата аммония. При микроскопировании было замечено преобладание грамположительных сферических прокариотов, с вкраплениями грамотрицательных бактерий и присутствием спор высших грибов. Отмечали отсутствие палочковидных форм. Индикатор Грисса прореагировал в каждом посеве с микрофлорой воды, что указывало на наличие нитритов и интересующих нас бактерий.

Таблица 2.

Учет выросших бактерий

Таблица 3.

Данные по выросшим прокариотам

Рисунок 3. Количество колоний выросших на питательном агаре с сульфат аммония

Рисунок 4. Количество колоний на 1см², сведенья со всех проб микрофлоры воды

Рисунок 5. Средний размер колоний во всех пробах микрофлоры

Последующие посевы проводили на пептонной воде, среде Виноградского, среде Гильтая и среде Эшби для выявления различных групп бактерий. Отмечали сильный неприятный запах выделяемых паров. В пробирке пробы воды озера Суерское на скошенном агаре наблюдалось выделение газа и пузырьков на белой пленке поверх среды. Заметны внутренние колонии – анаэробы. Преобладание грамположительных палочек, расположены последовательно друг за другом – цепью. Концы закруглены, палочки небольших размеров. Отмечали шарообразные бактерии, с закругленными концами, овальные бактерии. крупные скопления грамм+, грамм- палочковидные формы и коккообразной формы. Бактерии неправильной формы. Заинтересовали бактерии крупного овального размера, единичные формы с темными полюсами клетки, центральная часть клетки как будто бы просвечивала, сама клетка окрашена в фиолетовый цвет. Посев из озера Елошное отличался толстой белой, матовой пленкой, в которой большим количеством развивались аэробные микроорганизмы неправильной морфологии, разного размера.

Рисунок 6. Пробы воды озера Суерское на среде Гильтая (слева). Микрофлора проб Голубых озер на среде Эшби при комнатной температуре (справа)

Таблица 4.

Учет выросших колоний на разных средах

Выводы

В посевах на ГПС, питательном агаре, с добавлением в качестве питательных веществ сульфата аммония, среде Гильтая, среде Эшби, пептонной воде были выявлены грамположительные и грамотрицательные бактерии с разной морфологией. Возможно, выделенные бактерии принадлежат к семейству Pseudomonadaceae и Azotobacter, так как представители этого семейства неприхотливы в средах и окисляют азот [4, с.9].

В посевах микрофлоры поверхностных вод озер Курганской области преобладали грамположительные бактерии, следующей морфологии: сферические формы, диплококки (Azotobacter). Некоторое количество грамотрицательных палочковидных форм, которые образовывали капсулы.

При прорабатывании методов получения нитрифицирующих микроорганизмов в пробах исследуемой воды были отличия в количестве и размерах колоний, которые проявлялись достаточно ярко и указывали на систематическое положение.