Статья:

Исследование активности антиоксидантных ферментов у крыс с экспериментальной овариоэктомией на фоне заместительной гормональной терапии

Конференция: VIII Международная научно-практическая конференция «Научный форум: медицина, биология и химия»

Секция: Биохимия

Выходные данные
Максимович Д.И. Исследование активности антиоксидантных ферментов у крыс с экспериментальной овариоэктомией на фоне заместительной гормональной терапии // Научный форум: Медицина, биология и химия: сб. ст. по материалам VIII междунар. науч.-практ. конф. — № 6(8). — М., Изд. «МЦНО», 2017. — С. 19-26.
Конференция завершена
Мне нравится
на печатьскачать .pdfподелиться

Исследование активности антиоксидантных ферментов у крыс с экспериментальной овариоэктомией на фоне заместительной гормональной терапии

Максимович Дарья Игоревна
ассистент кафедры биохимии биологического факультета Белорусского Государственного Университета, Республика Беларусь, г. Минск

 

Research of the activity of antioxidant enzymes in rats with experimental ovariectomy using hormone replacement therapy

 

Darya Maksimovich

assistant of the Department of Biochemistry, Biology Faculty, Belarusian State University, Republic of Belarus, Minsk

 

Аннотация. Активация свободнорадикальных процессов лежит в основе процессов повреждения мембран клеток через нарушения их липидного состава. Одной из причин развития окислительного стресса является дефицит женских половых гормонов, который формируется у женщин на фоне естественной или хирургической менопаузы. Патогенетическим методом лечения климактерических расстройств и менопаузального метаболического синдрома является заместительная гормональная терапия. Достоверно известно, что гормональная заместительная терапия оказывает антиоксидантный эффект, однако, точно неизвестна эффективность фармакологической коррекции другими биологически активными веществами [1]. В данном исследовании рассматривалось влияние лактоферрина, экстракта ириса и этинилэстрадиола в различных концентрациях и комбинациях на активность таких антиоксидантных ферментов как супероксиддисмутаза и церулоплазмин у интактных и оперированных крыс.

Abstract. Activation of free radical processes underlies the processes of damage of cell membranes through interruption of their lipid structure. One of the reasons for the development of oxidative stress is the deficiency of female sex hormones, which is formed in women on background of natural or surgical menopause. Pathogenetic treatment for climacteric disorders and menopausal metabolic syndrome is hormone replacement therapy. It is well known that hormone replacement therapy has an antioxidant effect, however, the efficiency of pharmacological correction with other biologically active substances is not known exactly. In this study, the effects of lactoferrin, an extract of iris and ethinylestradiol in various concentrations and combinations on the activity of such antioxidant enzymes as superoxide dismutase and ceruloplasmin in intact and operated rats were examined.

 

Ключевые слова: активность антиоксидантных ферментов; активные формы кислорода; супероксиддисмутаза; церулоплазмин; овариоэктомия; окислительный стресс.

Keywords: activity of antioxidant enzymes; active forms of oxygen; superoxide dismutase; ceruloplasmin; ovariectomy; oxidative stress.

 

Степень эффективности заместительной гормональной терапии можно проследить по субъективным и объективным исследованиям. Одним из значимых методов диагностики эффективности заместительной гормональной терапии является изучение показателей активности антиоксидантных ферментов.

Цель данного исследования: изучение активности супероксиддисмутазы в гемолизате крови крыс и измерение уровня церулоплазмина в сыворотке крови крыс после овариоэктомии на фоне комплексной заместительной терапии.

Известно, что лактоферрин препятствует образованию свободных гидроксильных радикалов. Это обеспечивается за счет связывания белком железа, которое катализирует реакцию образования гидроксильного радикала. Кроме того, в результате последних исследований было обнаружено, что лактоферрин активирует ферменты антиоксидантной системы. [2]

Основанием для изучения эффективности действия экстракта ириса явилось высокое содержание в нем изофлавоноидов, которые, в свою очередь, являясь природными фитоэстрогенами, проявляют гормонзаменяющее действие, в том числе, ингибируют окисление соединений различных классов: липопротеинов низкой плотности, фосфолипидов и ДНК. [3]

Этинилэстрадиол относится к группе синтетических стероидов, и его действие аналогично природному эстрадиолу. Этинилэстрадиол вызывает пролиферацию эндометрия и способствует более интенсивному развитию маточных труб, матки, а также вторичных женских половых признаков в случаях их недоразвития. Это позволяет смягчить или устранить полностью в женском организме последствия, которые возникают вследствие недостаточной функции половых желез [4].

В эксперименте было использовано 90 белых беспородных крыс. Животных содержали в стандартных условиях вивария.

В качестве субстрата для СОД использовали раствор квертицина. В качестве источника фермента использовался гемолизат эритроцитов, разведенный в 1000 раз. Активность фермента определялась по степени ингибирования реакции автоокисления квертицина. Измерения оптической плотности проводились на спектрофотометре Solar PV 1251C при длине волны 406 нм. Единицы измерения – U/см3 [5].

Измерения количества церулоплазмина проводили в сыворотке крови крыс, по методике, основанной на окислении р-фенилендиамина. Ферментативная реакция останавливалась добавлением фтористого натрия. По оптической плотности окрашенного раствора судили о концентрации церулоплазмина. Измерения оптической плотности проводились на спектрофотометре Solar PV 1251C при длине волны 530 нм. Единицы измерения – мг/л [6].

Исследование активности супероксиддисмутазы в гемолизате эритроцитов показало (табл. 1), что у ложнооперированных животных активность СОД возросла на 14% по сравнению с интактными животными. Введение лактоферрина крысам интактной группы привело к увеличению активности СОД на 58% по сравнению с контрольной группой. Экстракт ириса в концентрации 40 мг/кг и 20 мг/кг, снизил данный показатель на 24% и 28% соответственно. 20% спирт оказал незначительное влияние на активность фермента. У интактных животных с введением экстракта ириса в дозе 40 мг/кг с одновременным введением лактоферрина 200 мг/кг наблюдалось возрастание активности фермента на 25%. У интактных животных с введением этинилэстрадиола в дозе 25 мкг/кг наблюдалось возрастание активности СОД на 61%

У крыс с овариоэктомией активность СОД снизилась на 32% по сравнению с контрольной группой. Фармакологическая коррекция лактоферрином 200 мг/кг повысила показатель на 30%, экстрактом ириса в дозе 40 мг/кг и 20 мг/кг повысила показатель более чем в 2 раза и на 33% соответственно, а совместное действие лактроферрина 200 мг/кг и экстракта ириса 40 мг/кг привело к увеличению показателя почти в 2,5 раза. Введение этинилэстрадиола в дозе 25 мг/кг и 25 мкг/кг в обоих случаях увеличило показатель оперированных крыс более чем в 2 раза.

Таблица 1

Активность супероксиддисмутазы

№ серии

Активность СОД, U/см3

Серия 1 Интактные животные (контроль)

35,55±2,8

Серия 2 Ложнооперированные животные

40,47±3,6**ин

Серия 3 Интактные животные + 20% спирт

36,81±3,38*ин

Серия 4 Интактные животные + ЛФ 200 мг/кг

56,23±5,35**ин

Серия 5 Интактные животные с введением с экстракта ириса в дозе 40 мг/кг

26,9±3,04**ин

Серия 6 Интактные животные с введением с экстракта ириса в дозе 20 мг/кг

25,47±3,06**ин

Серия 7 Интактные животные с введением с экстракта ириса в дозе 40 мг/кг + введение лактоферрина 200мг/кг

44,33±3,8**ин

Серия 8 Интактные животные с введением этинилэстрадиола в дозе 25 мкг/кг

57,3±4,8**ин

Серия 9 Животные с овариоэктомией

24,13±3,73**ин

Серия 10 Животные с овариоэктомией + введение лактоферрина в дозе 200 мг/кг

31,35±5,01**ов

Серия 11 Животные с овариоэктомией + введение этинилэстрадиола в дозе 25 мг/кг

49,08±3,44**ов

Серия 12 Животные с овариоэктомией + введение экстракта ириса в дозе 40 мг/кг

49,76±4,52**ов

Серия 13 Животные с овариоэктомией + введение экстракта ириса в дозе 20 мг/кг

32±4,01**ов

Серия 14 Животные с овариоэктомией + введение этинилэстрадиола в дозе 25 мкг/кг

59,02±5,33**ов

Серия 15 Животные с овариоэктомией с введением экстракта ириса в дозе 40 мг/кг + введение лактоферрина в дозе 200 мг/кг

59,71±5,45**ов

Примечания:

*ин - различия статистически незначимы (p > 0,05), **ин - различия статистически значимы (p < 0,05) в сериях № 2-9 относительно серии № 1.

*ов - различия статистически незначимы (p > 0,05), **ов - различия статистически значимы (p < 0,05) в сериях № 10-15 относительно серии № 9.

 

Определение содержания церулоплазмина в сыворотке крови крыс показало (табл. 2), что у ложнооперированных животных количество церулоплазмина незначительно возросло по сравнению с интактными животными, 20% спирт также увеличил данный показатель всего на 0,1%. Введение лактоферрина крысам интактной группы привело к увеличению содержания фермента на 4% по сравнению с контрольной группой, а экстракт ириса в концентрации 40 мг/кг и 20 мг/кг не оказал значимого воздействия на показатель. У интактных животных с совместным введением экстракта ириса в дозе 40 мг/кг и лактоферрина 200мг/кг и у интактных животных с введением этинилэстрадиола в дозе 25 мкг/кг наблюдалось возрастание количества церулоплазмина на 64% и 24% соответственно.

У крыс с овариоэктомией количество ЦП увеличилось на 26% по сравнению с контрольной группой. Фармакологическая коррекция лактоферрином повысила показатель еще на 11%, экстрактом ириса в дозе 40 мг/кг и 20 мг/кг повысила на 33% и на 21% соответственно, а совместное действие экстракта ириса в дозе 40 мг/кг и лактоферрина привело к снижению показателя на 11%. Введение этинилэстрадиола в дозе 25 мг/кг и 25 мкг/кг увеличило показатель оперированных крыс на 59% и 14% соответственно.

Таблица 2

Содержание церулоплазмина

№ серии

Cодержание церулоплазмина, мг/л

Серия 1 Интактные животные (контроль)

116,01±6,6

Серия 2 Ложнооперированные животные

117,25±6,8*ин

Серия 3 Интактные животные + 20% спирт

116,13±7,34*ин

Серия 4 Интактные животные + ЛФ 200 мг/кг

120,75±2,3**ин

Серия 5 Интактные животные с введением с экстракта ириса в дозе 40 мг/кг

121,63±8,8*ин

Серия 6 Интактные животные с введением с экстракта ириса в дозе 20 мг/кг

119,63±4,62*ин

Серия 7 Интактные животные с введением с экстракта ириса в дозе 40 мг/кг + введение лактоферрина 200мг/кг

189,88±6,7**ин

Серия 8 Интактные животные с введением этинилэстрадиола в дозе 25 мкг/кг

144,38±5,98**ин

Серия 9 Животные с овариоэктомией

157,50±3,8**ин

Серия 10 Животные с овариоэктомией + введение лактоферрина в дозе 200 мг/кг

174,13±4,7**ов

Серия 11 Животные с овариоэктомией + введение этинилэстрадиола в дозе 25 мг/кг

250,25±10,3**ов

Серия 12 Животные с овариоэктомией + введение экстракта ириса в дозе 40 мг/кг

210±9,1**ов

Серия 13 Животные с овариоэктомией + введение экстракта ириса в дозе 20 мг/кг

190,13±2,21**ов

Серия 14 Животные с овариоэктомией + введение этинилэстрадиола в дозе 25 мкг/кг

180,25±6,44**ов

Серия 15 Животные с овариоэктомией с введением экстракта ириса в дозе 40 мг/кг + введение лактоферрина в дозе 200 мг/кг

140,88±4,51**ов

Примечание:

*ин - различия статистически незначимы (p > 0,05), **ин - различия статистически значимы (p < 0,05) в сериях № 2-9 относительно серии № 1.

*ов - различия статистически незначимы (p > 0,05), **ов - различия статистически значимы (p < 0,05) в сериях № 10-15 относительно серии № 9.

 

Оперативное вмешательство является мощным фактором активации различных клеточных и биохимических реакций, в том числе окислительных процессов. Повреждение тканей неизбежно сопровождается воспалением. В каждом этапе развития воспаления (альтерации, экссудации, регенерации) участвуют активные формы кислорода (АФК), продуцируемые макрофагами, гранулоцитами, эндотелиальными клетками кровеносных сосудов. В результате активации макрофагальной НАДФН-оксидазы происходит увеличение продукции супероксиданион радикала, являющегося предшественником более реакционноспособных форм АФК (синглетного кислорода, гидроксил-радикала, пероксинитрита). Основной ролью различных форм АФК в развитии воспаления является повышение бактерицидной способности фагоцитов. Однако АФК эффективно действуют не только в отношении чужеродных микроорганизмов, но и в отношении собственных тканей организма. АФК, окисляя биологические макромолекулы клеток (белки, липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты), вызывают развитие деструктивных и, соответственно, метаболических нарушений в тканях.

Существует мнение, что митохондриальная и цитозольная изоформы супероксиддисмутазы являются наиболее уязвимыми для АФК. Выявленное нами понижение активности СОД после проведенной овариоэктомии можно связать с тем, что данный фермент сам существенно повреждается при гиперпродукции АФК.

Было выявлено, что введение лактоферрина, экстракта ириса и этинилэстрадиола существенно повышают активность супероксиддисмутазы после проведенной операции, что свидетельствует об эффективности заместительной гормональной терапии.

У крыс с овариоэктомией количество церулоплазмина увеличилось на 26% по сравнению с контрольной группой. Это можно объяснить тем, что после операционного вмешательства значительно возросла активность окислительных процессов, которые неизбежно приводят к образованию АФК и их предшественников. Известно, что ЦП не оказывает влияния на кинетику гибели супероксидных радикалов, однако он взаимодействует с их предшественниками – гидратированными электронами. Таким образом, в ответ на активное образование АФК и их предшественников повышается и уровень церулоплазмина в сыворотке крови.

Как и в случае с супероксиддисмутазой, было показано, что введение лактоферрина, экстракта ириса и этинилэстрадиола повышает уровень церулоплазмина после овариоэктомии, что так же свидетельствует об эффективности заместительной гормональной терапии. Однако совместное введение экстракта ириса в дозе 40 мг/кг и лактоферрина в дозе 200 мг/кг снижает показатель на 11%, что можно объяснить усилением прооксидантных свойств лактоферрина под действием экстракта ириса.

 

Список литературы:
1. Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Плотникова А.М., Федореев С.А., Кулеш Н.И., Мищенко Н.П. Влияние экстракта маакии амурской на липидный спектр и перикисное окисление липидов в мембранах эритроцитов после овариоэктомии у крыс // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2008. – Т. 71, №6. – С. 28-30.
2. Борзенкова Н.В., Балубушевич Н.Г., Ларионова Н.И. Лактоферрин: физико-химические свойства, биологические функции, системы доставки, лекарственные препараты и биологически активные добавки // Биофармацевтический журнал. – 2010. – Т.2, №3. – С. 3-19.
3. Уткина Е.А., Антошина С.В., Селищева А.А., Сорокоумова Г.М., Рогожкина Е.А., Швец В.И. Влияние на перикисное окисление фосфолипидов генистеина и дайдзеина, полученных кислотным гидролизом их гликозидов // Биорганическая химия. – 2004. – Т.30, №4. – С.429-435. 
4. Ерофеева Л.В. Применение комбинированного контрацептивного препарата, содержащего диеногест и этинилэстрадиол, при эндометриозе // МС. –  2016. – №2. – С.14-21.
5. Костюк В.А., Потапович, А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина. // Вопросы медицинской химии. – 1990. – Т.36. – №2. – C. 88–91. 
6. Камышников В.С. Клиническая биохимия / В. С. Камышников, В. Г. Колб. – Минск: Беларусь, – 1976. – 311 с.