Подбор праймеров и секвенирование поверхностных антигенов HA и NA вируса гриппа лошадей
Конференция: XIV Международная научно-практическая конференция «Научный форум: медицина, биология и химия»
Секция: Вирусология
XIV Международная научно-практическая конференция «Научный форум: медицина, биология и химия»
Подбор праймеров и секвенирование поверхностных антигенов HA и NA вируса гриппа лошадей
Design of primers and sequencing of the equine influenza virus HA and NA surface antigens
Yerbol Burashev
master, junior researcher, Research Institute for Biological Safety Problems, Kazakhstan, Gvardeyskyi
Talshyn Tlenchyeva
master, senior assistant , Research Institute for Biological Safety Problems, Kazakhstan, Gvardeyskyi
Kulayisan Sultankulova
candidates of biological sciences, professor, head of laboratory, Research Institute for Biological Safety Problems, Kazakhstan, Gvardeyskyi
Sergazy Nurabayev
senior researcher , Research Institute for Biological Safety Problems, Kazakhstan, Gvardeyskyi
Nurlan Kozhabergenov
master, researcher, Research Institute for Biological Safety Problems, Kazakhstan, Gvardeyskyi
Nurlan Sandybayev
candidates of biological sciences, professor, Deputy of Gen director ,Research Institute for Biological Safety Problems, Kazakhstan, Gvardeyskyi
Vitaliy Strochkov
senior researcher , Research Institute for Biological Safety Problems, Kazakhstan, Gvardeyskyi
Аннотация. В работе представлены результаты дизайна и синтеза праймеров, для последующей амплификации полных генов HA и NA вируса гриппа лошадей. Наработанные при помощи специфических праймеров гены были секвенированы на 16-capillary Genetic Analyzer 3130xl с использованием BigDye Terminator Sequencing Kit 3.1. Полученные нуклеотидные последовательности опубликованы в международной базе данных GenBank и в последующем эти данные будут использованы для проведения филогенетического анализа.
Abstract. The paper presents the results of selection and synthesis of primers, followed by amplification of the full HA and NA genes of the equine influenza virus. The genes obtained using specific primers were sequenced by using a 16-capillary Genetic Analyzer 3130xl sequencer with BigDye Terminator Sequencing Kit 3.1. The obtained nucleotide sequences are published in the international database of GenBank and subsequently these data will be used for phylogenetic analysis.
Ключевые слова: праймер; грипп лошадей; секвенирование; поверхностные антигены; ПЦР.
Keywords: primer; equine influenza; sequencing; surface antigens; PCR.
Введение
Коневодство в Республике Казахстан является одним из основных сельскохозяйственных секторов в экономике государства. Для успешного развития данной отрасли, прежде всего, необходимо обеспечить эпизоотическое благополучие по инфекционным болезням лошадей.
В Республике Казахстан у лошадей зарегистрировано более 30 инфекционных и инвазионных болезней, среди которых отмечено значительное влияние вируса гриппа [1].
Грипп лошадей (ГЛ) – относится к группе опасных вирусных болезней животных. Возбудитель ГЛ – РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Orthomyxoviridae, 80-120 нм в диаметре [2, 3]. Обладает чрезвычайно продуктивным механизмом рекомбинаций, обеспечивающим быструю антигенную изменчивость. Согласно экологической гипотезе сохранению возбудителя гриппа способствует переход вируса или его генов в популяцию животных [4, 5].
Первый штамм вируса гриппа лошадей A/equine/Prague/56 был выделен в 1956 году и имел антигенную формулу H7N7. Последний подтвержденный случай, вызванный подтипом H7N7 гриппа лошадей, был зарегистрирован в 1979 году. Штамм A/equine/Miami/63 подтипа H3N8 впервые был выделен в 1963 году [6,7,8]. Начиная с 1980 года, данный подтип вируса связан со всеми подтвержденными случаями заболевания.
В течение последних лет на территории Казахстана произошли две значимые вспышки ГЛ в 2007 и 2012 гг., в результате которых, были выделены новые штаммы A/equine/Otar/764/2007(H3N8) и A/equine/LKZ/9/2012(H3N8) соответственно. Как известно, среди сегментов вируса ГЛ наиболее подверженными антигенным изменениям являются поверхностные гены гемагглютинин и нейраминидаза HA и NA, предопределяющие субтип вируса гриппа. Для изучения молекулярно-биологических свойств данных штаммов были подобраны праймеры, позволяющие нарабатывать полноразмерные продукты ПЦР. В последующем очищенные ПЦР продукты были секвенированы, а полученные нуклеотидные последовательности опубликованы в международной базе данных GenBank [9]. В работе были секвенированы гены HA и NA вируса ГЛ штамм A/equine/LKZ/9/2012(H3N8).
Методы исследования
Подбор и синтез праймеров
Для подбора специфических праймеров использовали базу данных Primer-BLAST. Ввели необходимые параметры как длина ПЦР продукта 700-900 п.о., температура плавления 55-63 °С и ограничением слияний 5` конца прямого и 3` концом обратного праймеров 2 основания. Полученные последовательности проверяли на специфичность в программе BLAST и синтезировали на олигонуклеотидном синтезаторе Н‑16 Synthesizer, Germany.
Наработка сегментов HA и NA вируса ГЛ методом ПЦР
Гены HA и NA были наработаны с использованием набора SuperScript One-Step RT-PCR with Platinum Taq (Invitrogen SRL) согласно руководству производителя. Для амплификации каждого гена использовали три пары праймеров размером, 700-900 п.о. Перекрывание между ампликонами составило порядка 100 п.о. Секвенирование проводили при помощи оборудования 16-capillary Genetic Analyzer AB3130xl automatic sequencer (HITACHI Applied Biosystems) с использованием набора BigDye terminator version 3.1 cycle sequencing kit (ABI, Foster City, CA, USA). Анализ полученных результатов был проведен с использованием приложения Sequencer, version 5 и Bio Edit version 7.2.5. для выравнивания нуклеотидной последовательности.
Очистка ПЦР продуктов
Очистку ПЦР продуктов проводили с использованием набора «PCR Purification Kit» QIAGEN.
Секвенирование генов
Секвенирование проводили при помощи оборудования 16-capillary Genetic Analyzer AB3130xl automatic sequencer (HITACHI Applied Biosystems) с использованием набора BigDye terminator version 3.1 cycle sequencing kit (ABI, Foster City, CA, USA). Анализ полученных результатов был проведен с использованием приложения Sequencer, version 5 и Bio Edit version 7.2.5. для выравнивания нуклеотидной последовательности.
Результаты исследования
Для амплификации генов в результате работ были подобраны по три пары праймеров для HA и NA соответственно. Последовательности праймеров с установленными параметрами представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Праймеры для амплификации генов HA и NA вируса ГЛ
|
Primers |
Sequence (5'->3') |
Length |
Start |
Stop |
Tm |
GC% |
Self compl |
Self 3' compl |
|
For_HA1 |
GGCCTACAGTCAAAACCCAA |
20 |
45 |
64 |
58.01 |
50.00 |
4.00 |
0.00 |
|
Rev_HA1 |
CAGAGCTTTTCCCTGTTTTCA |
21 |
850 |
830 |
56.64 |
42.86 |
4.00 |
1.00 |
|
For_HA2 |
CCCGAGTTCAAATCAAGAGC |
20 |
603 |
622 |
56.81 |
50.00 |
5.00 |
2.00 |
|
Rev_HA2 |
ATTTTCTAGAGCCACCAGCA |
20 |
1350 |
1331 |
56.82 |
45.00 |
6.00 |
3.00 |
|
For_HA3 |
TCAGAGGAATCTTTGGAGCAA |
21 |
1034 |
1054 |
56.92 |
42.86 |
3.00 |
3.00 |
|
Rev_HA3 |
TCTGATGTTGCCTTTTTGGC |
20 |
1686 |
1667 |
57.18 |
45.00 |
3.00 |
2.00 |
|
For_NA1 |
AGCTAGGTTTGAATCGGTGG |
20 |
48 |
67 |
57.60 |
50.00 |
4.00 |
0.00 |
|
Rev_NA1 |
TCAGTTCCTTGTCGAAACCC |
20 |
608 |
589 |
57.75 |
50.00 |
4.00 |
0.00 |
|
For_NA2 |
CTTTTTCCTCACACAGGGCT |
20 |
387 |
406 |
58.01 |
50.00 |
3.00 |
2.00 |
|
Rev_NA2 |
CTCTCCCCTAGGAGTGTCAG |
20 |
981 |
962 |
57.93 |
60.00 |
6.00 |
2.00 |
|
For_NA3 |
AAGTTTCAATGGGGGACACA |
20 |
801 |
820 |
57.23 |
45.00 |
3.00 |
1.00 |
|
Rev_NA3 |
GAAGAATAGCTCCATCGTGCC |
21 |
1390 |
1370 |
58.86 |
52.38 |
4.00 |
2.00 |
С использованием вышеуказанных праймеров были наработаны гены HA и NA вируса ГЛ. Размер продуктов ПЦР составлял порядка 650-840 п.о. с перекрытием более 100 нуклеотидов, что обеспечило чистые считывания при секвенировании. При постановке ПЦР набором Super Script One-Step RT-PCR with Platinum Taq использовали стандартные условия производителя, за исключением оптимизации температуры отжига праймеров (55-58 °С). Результаты ПЦР представлены в виде электрофоретических снимков ампликонов на рисунке 1.
Рисунок 1. Электрофоретический снимок ампликонов генов HA и NA вируса ГЛ соответственно
Полученные ПЦР продукты очищали с использованием набора «PCR Purification Kit» QIAGEN и провели прямое секвенирование. Полученные нуклеотидные последовательности собирали при помощи приложения Sequencer, version 5. После обработки последовательности генов HA и NA были опубликованы в международной базе данных GenBank под номерами KP202378 и KP202374 соответственно.
Выводы
В результате проведенных работ были подобраны и синтезированы специфические праймеры для амплификации полных последовательностей генов HA и NA вируса гриппа лошадей. При постановке ПЦР, после оптимизации температуры отжига праймеров, были наработаны все ампликоны исследуемых генов, которые после надлежащей очистки были секвенированы.
Обработанные последовательности были опубликованы в базе данных GenBank и в последующем могут быть использованы для проведения филогенетического и молекулярно-эпидемиологического анализа.
