Серин-треониновые протеинкиназы – кандидаты в биомишени для коррекции таксономического состава кишечной микробиоты при диабете 2 типа

Serine-threonine protein kinases – candidates for biotargets for correction taxonomic composition of the gut microbiota in type 2 diabetes

Natalia Zakharevich

Ph.D. in Biological Sciences, Senior Researcher Laboratories of Genetics of Microorganisms Vavilov Institute of General Genetics Russian Academy of Sciences, Russian Federation, Moscow

Valery Danilenko

Dr. of Biological Sciences, Professor, Head of Department of Genetic Basics of Biotechnology Vavilov Institute of General Genetics Russian Academy of Sciences, Russian Federation, Moscow

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-34-00645 мол_а.

Аннотация. У больных с диабетом 2 типа (Д2Т) меняется таксоно­мический состав кишечной микробиоты (КМ). В связи с этим в данном исследовании предложен подход по коррекции таксономического состава КМ – новой потенциальной биомишенью могут стать бактериальные серин-треониновые протеинкиназы (СТПК), для воздействия на которые можно использовать селективные ингибиторы. Для решения поставлен­ной задачи нами был проведен биоинформатический анализ метагеном­ных образцов КМ от лиц с Д2Т и от контрольной группы лиц. В ходе анализа нами были выявлены кандидаты в биомишени – СТПК тех групп бактерий, количество которых было увеличено в метагеномных образцах от лиц с Д2Т по сравнению с контрольной группой.

Abstract. In patients with type 2 diabetes (T2D), the taxonomic composition of the gut microbiota (GM) changes. In this regard, in this study, an approach was proposed to correct the taxonomic composition of GM – a new potential biotarget could be bacterial serine-threonine protein kinases (STPK), which can be influenced by selective inhibitors. To solve this problem, we carried out a bioinformatic analysis of GM metagenomic samples from individuals with T2D and from the control group. During the analysis, we identified candidates for biotargets – STPK of those groups of bacteria, the number of which was increased in metagenomic samples from individuals with T2D compared with the control group.

Ключевые слова: серин-треониновые протеинкиназы; селективные ингибиторы; кишечная микробиота; диабет 2 типа

Keywords: serine-threonine protein kinases; selective inhibitors; gut microbiota; type 2 diabetes

Введение. В последние годы уделяется огромное внимание изучению кишечной микробиоты (КМ) человека. Микроорганизмы формирующие КМ поддерживают функционирование не только самого микробного сообщества, но и организма хозяина в целом [2, 15]. В норме состав КМ сбалансирован (по родам и видам), но при различных заболеваниях таксономический баланс нарушается [5, 7, 15, 18]. Изменения в таксономическом балансе наблюдаются, например, при диабете 2 типа (Д2Т) [11, 15]. На сегодняшний день Д2Т – является одной из крупнейших мировых проблем, и приобретает, к сожалению, все большее распространение.

Разработка различных подходов по коррекции таксономического состава КМ человека является важной и актуальной задачей. Наиболее известными подходами по коррекции состава КМ являются диеты, прием пробиотиков и антибиотиков, а также хирургические вмешательства.

Все эти подходы, зачастую, только способствуют развитию дисбиотических расстройств, так как они одновременно воздействуют на широкий спектр микроорганизмов. Новой потенциальной биомишенью для коррекции состава КМ человека могут стать серин-треониновые протеинкиназы (СТПК), для воздействия на которые можно использовать селективные ингибиторы.

В настоящее время, во многих работах, ингибиторы СТПК рассматриваются в качестве многообещающих антимикробных агентов [3, 6, 10].

СТПК идентифицированы в большинстве бактериальных геномов. СТПК являются одной из ключевых систем, участвующих в передаче сигналов у бактерий и вовлечены в регуляцию различных процессов жизнедеятельности микроорганизмов, в том числе в процессы роста и деления клетки [13, 17]. Воздействуя на СТПК определенных групп бактерий селективными ингибиторами можно подавлять рост этих микроорганизмов [3, 6, 10].

По сравнению с антибиотиками селективные ингибиторы СТПК являются более мягким инструментом, воздействующим на КМ так как они замедляют рост и деление определенных, выбранных исследователем, групп бактерий.

Ранее нами (лаборатория генетики микроорганизмов ИОГен РАН) была разработана классификация бактериальных СТПК [22]. В основе разработанной классификации лежит сигнатура из 9 амино­кислотных остатков, расположенных в области связывания аденина. На основе сигнатуры, СТПК и содержащие их роды бактерий были разделены на группы [1, 22]. СТПК с одинаковой сигнатурой, относя­щиеся к одной группе, способны взаимодействовать со сходными низкомолекулярными веществами, которые могут быть использованы в качестве селективных ингибиторов СТПК [1, 22]. Такие ингибиторы хороши тем, что они селективны и по отношению к бактериальным родам, содержащим протеинкиназы с различными сигнатурами. Таким образом, используя предлагаемые селективные ингибиторы можно до­биться замедления роста определенных бактериальных групп (родов) [1]. Согласно этой концепции, селективные ингибиторы бактериальных СТПК могут стать новым, более мягким инструментом, способным корректировать таксономический состав КМ, и который может быть использован в качестве дополнительного средства при борьбе с такими заболеваниями как Д2Т и др.

Стоит отметить, что, воздействуя селективными ингибиторами на СТПК, включая СТПК симбионтов человека, можно влиять на таксономический состав КМ человека, не убивая при этом пробиотические микроорганизмы, а лишь замедляя их рост и функционирование.

При диабете 2 типа это особенно важно, так как из литературы известно, что при данном заболевании увеличивается количество бактерий рода Lactobacillus – важной пробиотической составляющей КМ человека [9].

В данной работе предлагается проанализировать метагеномные образцы КМ от лиц с диабетом 2 типа и от контрольной группы лиц и идентифицировать СТПК тех групп бактерий, наличие и количество которых будет отлично у лиц с Д2Т по сравнению с контрольной группой. Выявленные СТПК могут стать потенциальными биомишенями для селективных ингибиторов, разработка и применение которых позволит корректировать таксономический состав КМ при Д2Т.

Материалы и методы. Для поиска СТПК в кишечных метагеномах был создан каталог, содержащий СТПК встречающиеся в 55 основных бактериальных родах, формирующих КМ здорового человека. Для сравнительного метагеномного анализа было выбрано два набора данных (Таблица 1), находящихся в свободном доступе в международной базе данных «Европейский архив нуклеотидов» (The European Nucleotide Archive, EMBL, https://www.ebi.ac.uk/ena), а также в базе данных GigaDB (http://gigadb.org/).

Таблица 1.

Характеристики анализируемых метагеномных образцов

Все анализируемые в работе метагеномы были собраны при помощи программы MetaSpades [14]. В собранных метагеномах были предсказаны открытые рамки считывания (ОРС) с помощью программы MetaGeneMark [24]; на выходе были отобраны аминокислотные последовательности соответствующие предсказанным ОРС, для каждого метагенома.

Было проведено сравнение полученного набора аминокислотных последовательностей (для каждого метагенома) с каталогом СТПК, при помощи программы BLASTPp [4]. По результатам проведенного сравнения для каждого метагенома был получен набор СТПК, иденти­фицированных в нём (на этом этапе проводился дополни­тельный таксономический анализ для СТПК при помощи программы Kaiju [12]).

Для всех исследуемых метагеномов был так же проведен таксономический анализ при помощи программы MetaPhlAn2 [20]. По результатам таксономического анализа были отобраны роды бактерий чьё количество было увеличено в образцах от людей с диабетом 2 типа, по сравнению с контрольной группой.

Для слаженной работы всех используемых программ и миними­зации временных затрат были написаны скрипты на следующих языках программирования: Python (ver. 2.6 и 3.1), BASH.

Результаты и обсуждение. По результатам сравнительного таксономического анализа 126 кишечных метагеномов здоровых людей и 114 кишечных метагеномов от людей с диабетом 2 типа из двух независимых исследований (Таблица 1) [8, 16], нами было отобрано 8 бактериальных родов (Acidaminococcus, Desulfovibrio, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Megamonas, Megasphaera, Parvimonas) – чьё количество было значительно увеличено в обоих исследованиях (Рисунок 1).

Этнические различия между популяциями людей, различия в возрасте и ряд других факторов могут влиять на состав микробиоты. Это стоит учитывать и в нашем исследовании, так как было взято два различных набора данных, описывающих людей из разных стран, а также отличающихся по возрасту. Так, несмотря на то, что значения на рисунке 1Б не так сильно различаются между контрольной группой и группой с Д2Т для рода Desulfovibrio, данный род все равно был взят для рассмотрения. Это обусловлено тем, что на сегодняшний день в ряде исследований описано значительное увеличение количества микроорганизмов, относящихся к семейству Desulfovibrionaceae у людей с ожирением и диабетом 2 типа [21, 23]. Такое увеличение количества данных микроорганизмов может быть связано с тем, что они являются потенциальными производителями эндотоксинов, которые могут быть причиной хронических воспалений в кишечнике, сопутствующих Д2Т. Помимо этого стоит отметить, что на рисунке 1Б отсутствует род Megamonas.

Дело в том, что для данного набора метагеномов (данные из исследования Karlsson и соавторов [8]) род Megamonas был нами идентифицирован только в метагеномах из группы с Д2Т, а в метагеномах контрольной группы здоровых людей данный род идентифицирован не был.

После проведения таксономического анализа, из наборов СТПК (см. Материалы и методы) от метагеномов с Д2Т, были отобраны СТПК принадлежащие 8 выбранным бактериальным родам. Киназы были отобраны для всех родов кроме рода Parvimonas, для которого не удалось идентифицировать ни одной СТПК в анализируемых метагеномных образцах. Возможно, это обусловлено низким количественным содержанием данного рода в исследуемых метагеномах, что хорошо видно на рисунке 1 (А, Б).

Рисунок 1. На рисунке представлены медианные значения относительного содержания в КМ родов, количество которых было увеличено для лиц с Д2Т, в проанализированных метагеномах. Значения для метагеномных данных из исследования Qin и соавторов (А); значения для метагеномных данных из исследования Karlsson и соавторов (Б). Относительное содержание микроорганизмов в метагеномах получено с помощью программы MetaPhlAn2. По оси y данные представлены в логарифмическом масштабе

Во всех отобранных СТПК была идентифицирована сигнатура из 9 аминокислотных остатков. На основе определенной сигнатуры, протеинкиназы были разбиты на группы, согласно разработанной нами ранее классификации [22]. Далее, так как целью работы стоит предложить такие биомишени (СТПК), воздействие на которые будет максимально безопасно для человека, мы сравнили сигнатуры (а, следовательно, и группы) отобранных нами СТПК с сигнатурами (группами) характерными для человеческих киназ (Рисунок 2). Распределение человеческих киназ по группам, согласно разработанной классификации, было выполнено и описано нами ранее [1].

Рисунок 2. На диаграмме представлены группы (обозначены римскими цифрами) к которым относятся человеческие протеинкиназы – серый круг, и группы к которым относятся протеинкиназы из 7 отобранных бактериальных родов (отсутствует род Parvimonas для которого не были идентифицированы СТПК) – белый круг. На пересечении те группы, к которым относятся как человеческие, так и бактериальные протеинкиназы

Как видно из диаграммы на рисунке 2, на данном этапе иссле­дования, по результатам сравнительного анализа сигнатур (групп), в качестве кандидатов в биомишени можно предложить СТПК из следующих четырех бактериальных родов: Acidaminococcus (WP_009015884.1), Desulfovibrio (WP_062252584.1), Lactobacillus (WP_103205347.1), Leuconostoc (WP_036087829.1). В скобочках указаны идентификаторы конкретных СТПК из базы данных NCBI. Предложенные СТПК можно использовать как модели при поиске селективных ингибиторов.

Род Lactobacillus представляет собой гетерогенную популяцию бактерий [19], различающихся по культуральным, биохимическим и прочим характеристикам – в связи с чем, не удивительно, что на представленной диаграмме (Рисунок 2) различные СТПК данного рода относятся к разным группам классификации.

В заключение стоит отметить сигнатуру, идентифицированную у СТПК из рода Acidaminococcus. Данные СТПК были отнесены нами в группу к протеинкиназам с уникальными сигнатурами, так как ранее мы не встречали аналогичную сигнатуру.

Но, возможно, протеинкиназы с такими сигнатурами можно даже отнести в отдельную группу, и расширить классификацию, предложен­ную нами ранее.

Также стоит отметить, что выбор двух наборов данных для данного исследования, отличающихся друг от друга как минимум по двум параметрам (этническая принадлежность и возраст), в некоторой степени, был сделан нами преднамеренно, для того чтобы найти закономерности, характерные для обоих выборок.

Полученные в данной работе результаты призваны помочь в поиске селективных ингибиторов СТПК для конкретных бактериальных родов и видов кишечной микробиоты человека.

Что, в свою очередь, приближает нас на ещё один шаг к разработке более мягкого, чем существующие, инструмента, способного корректи­ровать таксономический состав КМ.