Методика количественного определения производного 1,3,4-тиадиазола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим, спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием

METHOD FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE 1,3,4-THIADIAZOLE DERIVATIVE BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH FLUORIMETRIC, SPECTROPHOTOMETRIC AND MASS SPECTROMETRIC DETECTION

Nadezhda Sipkina

Researcher, St. Petersburg State Chemical Pharmaceutical University, Russia, St. Petersburg

Igor Yakovlev

Doctor of Chemistry, associate Professor, St. Petersburg State Chemical Pharmaceutical University, Russia, St. Petersburg

Аннотация. Целью настоящей работы является разработка методик количественного определения для нового противогрибкового лекарственного средства хлорида 2-[(Z)-1-(3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-2(3H)-илиден)метил]-3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-3-ия (ТДЗ) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим, спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием. Для разработанных методик были установлены такие валидационные параметры как: предел обнаружения, предел количественного определения, линейный диапазон, правильность и прецизионность. Описанные методики ВЭЖХ были применены для количественного определения ТДЗ в фармацевтической субстанции, таблетках с содержанием основного действующего вещества 60 мг и биологических жидкостях при изучении фармакокинетики.

Abstract. The aim of this work is the development methods for the quantitative determination of the new antifungal drug (2-[(Z)-1-(3,5-diphenyl-1,3,4-thiadiazol-2(3H)-ylidene)-methyl]-3,5-diphenyl-1,3,4-thiadiazol-3-ium chloride (TDZ) by HPLC with fluorimetric, spectrophotometric and mass spectrometric detection. For the developed methods, such validation parameters were established as: limit of detection, limit of quantification, linearity range, accuracy and precision. The described HPLC methods were used to quantify TDZ in a pharmaceutical substance, tablets with a content of the main substance of 60 mg and biological liquids in the study of pharmacokinetics.

Ключевые слова: количественное определение; высокоэффективная жидкостная хроматография; тиадиазолы.

Keywords: quantification; high performance liquid chromatography; thiadiazoles.

В рамках Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» в Санкт-Петербургском государственном химико-фармацевтическом университете было синтезировано новое соединение хлорид 2-[(Z)-1-(3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-2(3H)-илиден)метил]-3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-3-ия (ТДЗ, рис. 1) [3], а также установлено, что полученное производное тиадиазола обладает антифунгальной активностью на уровне существующих на рынке противогрибковых препаратов, таких как флуконазол и вориконазол [1, с.348; 2, с. 18]. Целью настоящей работы является разработка методик количественного определения ТДЗ в биологических жидкостях методом ВЭЖХ для получения фармакокинетических данных в доклинических исследованиях нового противогрибкового лекарственного средства.

Рисунок 1. Структурная формула хлорида 2-[(Z)-1-(3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-2(3H)-илиден)метил]-3,5-дифенил-1,3,4-тиадиазол-3-ия (ТДЗ)

Хроматографический процесс осуществляли при изократическом элюировании в обращённо-фазовом режиме на колонках с привитыми октильными группами (C8) со следующими геометрическими параметрами: 250 мм × 4.6 мм (размер частиц 5 мкм) и 150 мм × 2.1 мм (размер частиц 3.5 мкм). В качестве элюента использовали смесь ацетонитрила и 0,03% раствора трифторуксусной кислоты в соотношении 65:35 при скорости потока подвижной фазы 1,0 мл/мин при использовании хроматографической колонки диаметром 4,6 мм и 0,2 мл/мин для колонки диаметром 2,1 мм. В обоих случаях объём вводимой пробы составил 20 мкл. Для детектирования использовали три типа детекторов: флуориметрический, диодно-матричный и масс-спектрометрический. В случае флуориметрического детектора хроматограммы регистрировали при длине волны возбуждения 435 нм и длине волны испускания 520 нм, длина волны поглощения ТДЗ ультрафиолетовой области составила 435 нм. Масс-спектрометрическое детектирование осуществляли в режиме положительной ионизации методом электроспрей (ESI) при использовании сингл-квадроуполя в качестве фильтра масс.

Валидацию разработанных методик проводили с использованием стандартных и модельных растворов согласно требованиям Государственной Фармакопеи РФ. Полученные валиационные характеристики методик представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Валидационные характеристики методик количественного определения ТДЗ

Приготовление испытуемых растворов фармацевтической субстанции и таблеток осуществляли путем соответствующего разбавления точной навески препаратов. В качестве растворителя в обоих случаях использовали подвижную фазу.

Подготовку испытуемых растворов биологических жидкостей (кровь, моча) проводили путем осаждения белков и форменных элементов с помощью добавления ацетонитрила при постоянной обработке растворов ультразвуком с последующим разбавлением проб 0,03% раствором трифторуксусной кислоты.

В зависимости от предполагаемой концентрации ТДЗ в анализируемых растворах использовали соответствующую методику анализа и способ детектирования. Испытуемые растворы анализировали в заданных условиях, рассчитывая содержание ТДЗ в растворах с помощью калибровочного графика, полученного при валидации выбранной методики.

Типичные хроматограммы испытуемых растворов для количественного определения ТДЗ, полученные с помощью флуориметрического, диодно-матричного и масс-спектрометрического детекторов, представлены на рисунке 2.

Рисунок 2. Хроматограммы испытуемых растворов: а) раствор таблетки ТДЗ – спектрофотометрическое детектировании при длине волны 435 нм;б) экстракт плазмы крови крысы – флуориметрическое детектирование при длине волны возбуждения 435 и длине волны эмиссии 520 нм; в) экстракт плазмы крови крысы – масс-спектрометрическое детектирование  [М⁺]=489m/z