Применение мирамистина для деконтаминации монослойной клеточной линии из почки сибирского горного козерога (ПСГК-60) от Mycoplasma gallisepticum

THE USE OF MIRAMISTIN FOR DECONTAMINATION OF A MONOLAYER CELL LINE FROM A SIBERIAN MOUNTAIN IBEX KIDNEY (SMIK-30) FROM MYCOPLASMA GALLISEPTICUM

Maxim Doronin

Candidate of Biological Sciences, Researcher, Federal Center for Animal Health, Russia, Vladimir

Dmitry Mikhalishin

Candidate of Veterinary Science, Head of Laboratory, Federal Center for Animal Health, Russia, Vladimir

Vyacheslav Starikov

Candidate of Veterinary Sciences, Leading Researcher, Federal Center for Animal Health, Russia, Vladimir

Marina Guseva

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Federal Center for Animal Health, Russia, Vladimir

Аннотация. Проведена деконтаминация перевиваемой монослойной клеточной линии из почки сибирского горного козерога (ПСГК-60) от Mycoplasma gallisepticum с активностью 8,0 lg в реакции гемагглютинации с помощью 25 мкг/мл мирамистина в течение 8 последовательных пассажей.

Abstract. The transplanted monolayer cell line from the kidney of the Siberian mountain ibex (SMIK-30) from Mycoplasma gallisepticum with an activity of 8.0 lg in the hemagglutination reaction was decontaminated using 25 mcg/ml miramistin for 8 consecutive passages.

Ключевые слова: мирамистин; культура клеток ПСГК-60; деконтаминация; Mycoplasma gallisepticum.

Keywords: miramistin; SMIK-30 cell culture; decontamination.

Введение. В процессе промышленного производства ветеринарных препаратов и диагностики вирусных заболеваний широко применяются перевиваемые монослойные клеточные линии [2]. Существует проблема их контаминирования микоплазмами, особенно при использовании сывороток крови животных в составе питательных ростовых сред [9, 11]. В соответствии с современной классификацией микроорганизмов микоплазмы относятся к семейству Mycoplasmatacea, роду Mycoplasma [11]. Среди контаминантов клеточных линий часто встречается Mycoplasma gallisepticum. Микоплазмы могут обнаруживаться в клеточных линиях, полученных из тканей дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, почек, половых органов и др. [8]. Данные микроорганизмы прикрепляются к плазмалемме клетки, поглощают из нее важнейшие анаболиты и факторы роста, что приводит к деструктивным процессам в клетке. Микоплазмы индуцируют значительные изменения в митотическом цикле, что может выражаться в изменениях процессов репликации и репарации ДНК, появлении хромосомных аберраций, изменении стадий транскрипции и трансляции, а также индукции экспрессии цитокинов. Такие продукты жизнедеятельности микоплазм как перекись водорода и гидроокись аммония вызывают формирование цитотоксического эффекта [1, 7]. Возникающие под действием микоплазм изменения в клетках монослойных линий приводят к резкому снижению качества продукции, накоплению токсинов, уменьшению количества целевого компонента в готовой продукции и к искажению результатов лабораторных исследований, в которых монослойные культуры клеток применяют в качестве тест-систем [2, 5].

Монослойная клеточная линия ПСГК-60 применяется для культивирования и в качестве диагностических тест-систем по отношению к вирусам различных таксономических групп [2, 9].

В настоящее время контаминацию монослойных клеточных линий обнаруживают культуральными, серологическими, молекулярно-генетическими и другими физическими и биологическими методами [5, 6].

С целью деконтаминации монослойных культур клеток применяют различные антибактериальные препараты, в частности, тетрациклины, макролиды и фторхинолоны [2, 3, 4, 10]. Обнаруживается высокая чувствительность микоплазм к соединениям, уменьшающим поверхностное натяжение (холевая кислота, дезоксихолат и др.) [4, 5]. При этом проблема деконтаминации остается полностью не разрешенной, поскольку многие препараты малоэффективны или цитотоксичны.

В настоящее время в медицинской и ветеринарной практике в борьбе с различными микроорганизмами применяют мирамистин (бензилдиметил [3-(миристоиламино)пропил] аммоний хлорид моногидрат, C₂₆H₄₇ClN₂O), который обладает широким бактерицидным действием. Препарат относится к является четвертичным аммонийным соединения, принадлежащим к группе поверхностно-активных катионных антисептиков. Механизм действия мирамистина заключается в процессе активного взаимодействия радикалов N⁺ и Cl^- с липидными и полисахаридными составляющими цитоплазматической мембраны микоплазм, что приводит к гибели патогенов [5, 8, 10, 11].

Цель данного исследования заключалась в оценке возможности применения мирамистина для деконтаминации от часто встречающейся Mycoplasma gallisepticum в перевиваемой монослойной клеточной линии из почки сибирского горного козерога (ПСГК-60).

Материалы и методы. Клеточная линия. В работе использовали перевиваемую монослойную линию клеток из почки сибирского горного козерога (ПСГК-60) свободную от микоплазм.

Микоплазма. В работе применяли производственный штамм «S6» Mycoplasma gallisepticum в виде суспензии с активностью в реакции гемагглютинации (РГА) 7,0 log₂ [6].

Антибиотик. Для деконтаминации применяли антибактериальный препарат мирамистин (ООО «Скандия Эко», Россия) с дозой в культуральной среде 25 мкг/см³.

Детекция микоплазмы с помощью питательных сред и в реакции гемагглютинации. Исследования на наличие живой микоплазмы проводили на элективной жидкой и твердой питательной среде Фрея с добавлением никотинамидадениндинуклеотида (NAD(H)⁺) и цистеина гидрохлорида.

Детекция микоплазмы в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Экстрагирование геномной ДНК микоплазмы проводили с использованием набора реагентов «Extract DNA». Наличие генома Mycoplasma gallisepticum оценивали с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с применением набора «Myco Real-Time» с применением специфичных праймеров и зонда TaqMan.

Контроли. Положительным контролем служила суспензия Mycoplasma gallisepticum с активностью в РГА 7,0 log₂. В качестве отрицательного контроля использовали суспензию клеток линии ПСГК-60, свободную от микоплазмы.

Процесс деконтаминации монослойной культуры клеток ПСГК-60 от микоплазмы. Монослойную линию клеток ПСГК-60 заражали штаммом «S6» Mycoplasma gallisepticum с активностью 7,0 log₂ так, чтобы доза заражения составляла 3,0 log₂. Данное количество вносили в 10 культуральных флаконов с площадью рабочей поверхности 25 см² и посевной концентрацией клеток 250-300 тыс./мл. Инкубацию осуществляли при температуре 37±0,2°С в течение 48 ч.

Для деконтаминации удаляли среду из культуральных флаконов, промывали клетки 0,067 М фосфатно-солевым буферным раствором и снимали их с поверхности с помощью 0,25%-го раствора трипсина и 0,02%-го раствора версена (1:10), нагретого до 37,0±0,5°С. В полученных суспензиях определяли концентрацию клеток и проводили их посев во флаконы со свежей средой, в которую было добавлено 25 мкг/мл мирамистина. Культивирование клеток в каждом пассаже осуществляли в течение 48 ч в стандартных условиях. Представленный цикл проводили в течение 8 последовательных пассажей. До контаминации и после каждого пассажа образцы клеток исследовали на наличие микоплазменного загрязнения методом высева на питательные среды и определяли активность микоплазмы в РГА, а также исследовали в ПЦР-РВ.

Статистическая обработка данных. Исследование проводили в трех повторностях. Вычисляли средние арифметические значения, степень достоверности статистической разницы между средними величинами, определенными по разностному методу Стьюдента-Фишера.

Результаты и обсуждение. На предыдущих этапах исследования цитотоксического влияния мирамистина на клетки линии ПСГК-60 доказали, что наличие данного антибиотика в дозе 25 мкг/мл среды не вызывало снижения пролиферативной активности клеток [3]. Исходя из этого в данном исследовании по деконтаминации культуры клеток ПСГК-60 от микоплазмы применяли мирамистин в указанной концентрации.

Суспензию клеток до заражения Mycoplasma gallisepticum исследовали с помощью высева на селективной среде Фрея с добавлением NAD(H)⁺ и цистеина гидрохлорида, а также в ПЦР-РВ. В результате выявили, что исходные образцы не содержали микоплазму.

Клетки линии ПСГК-60, не контаминированные микоплазмой, заражали производственным штаммом «S6» Mycoplasma gallisepticum с активностью 7,0 log₂. Доза заражения составляла 3,0 log₂. После инкубации клеток в среде с микоплазмой в течение 48 ч клеточный монослой диспергировали и отбирали пробу для проведения высева на элективной жидкой и твердой питательной среде Фрея, а также в ПЦР-РВ. В результате анализа выявили, что активность микоплазмы в РГА составляла 7,0 log₂. При проведении ПЦР-РВ выявили, что 10 суспензий клеток линии ПСГК-60 содержали геном микоплазмы со значениями порогового цикла амплификации (C_t) 9,74±0,08. Для положительного контроля C_t составлял 9,78±0,07, что соответствовало активности в РГА 7,0 log₂.

Проводили деконтаминацию 10 образцов клеточной линии ПСГК-60 от микоплазм с помощью мирамистина в концентрации 25 мкг/мл. Процедуру очистки культуры клеток от Mycoplasma gallisepticum осуществляли в соответствии с методикой, описанной выше. После каждого пассажа образцы клеток исследовали на наличие живой микоплазмы с помощью высева на питательную среду Фрея и на наличие генома в ПЦР-РВ. Результаты анализа представлены в таблице 1.

В процессе деконтаминации происходило изменение окраски с розового на оранжевый цвет (закисление) и помутнение жидкой среды, что свидетельствовало о развитии микоплазмы в суспензиях 1–7 пассажей. При высеве данных проб на твердую среду Фрея были обнаружены колонии, которые по морфологическим и культуральным свойствам характерны для представителей семейства Mycoplasmataceae.

Таблица 1.

Результаты исследования суспензий клеточной линии ПСГК-60, подвергнутых деконтаминации от Mycoplasma gallisepticum (n = 10)

«–» – не выявлено наличие генома микоплазмы;

* исследования проведены в трех повторениях, значения идентичны друг другу, анализ проводился с шагом 0,25 log₂.

Из данных таблицы видно, что очищение клеток линии ПСГК-60 от микоплазмы с исходной активностью 7,0 log₂ при использовании мирамистина в дозе 25 мкг/мл проведено за 8 последовательных пассажей. При этом на 1-7 пассажах активность Mycoplasma gallisepticum в РГА снижалась и составляла 7,0; 6,0; 5,0; 4,0; 3,0; 2,0; 1,0 log₂, соответственно. Активность микоплазмы в положительном контроле была равна 7,0 log_2, в отрицательном – 0,0 log₂. При исследовании данных суспензий в ПЦР-РВ выявили, что с 1 по 7 пассажи средние значения C_t для клеток линии ПСГК-60 составляли 9,74 ± 0,05; 13,10 ± 0,07; 16,41 ± 0,08; 19,75 ± 0,07, 23,07 ± 0,08; 23,37 ± 0,06; 29,74 ± 0,07. Значение C_t для положительного контроля было равно 9,78 ± 0,07, что означало наличие микоплазмы в образцах.

В отрицательном контроле ДНК возбудителя не выявлена.

При высеве проб 8 пассажа на жидкую и твердую среды Фрея рост микроорганизмов отсутствовал, и геном микоплазмы в ПЦР-РВ не был детектирован, что свидетельствовало о полной деконтаминации полученных образцов клеток от Mycoplasma gallisepticum. При этом после 8 пассажей в среде с данным количеством мирамистина клетки сохраняли свою форму (эпителиоподобные), размер (10-12 мкм) и пролиферативную активность 6-8 при посевной концентрации 250-300 тыс./мл.

Заключение. Определено, что деконтаминировать клетки перевиваемой монослойной линий ПСГК-60 от Mycoplasma gallisepticum с активностью в реакции гемагглютинации 7,0 log₂ возможно с использованием мирамистина в дозе 25 мкг/мл в течение 8 последовательных пассажей без возникновения общего цитотоксического эффекта. Доказана эффективность применения данного антибиотика для очищения клеточной линии ПСГК-60 от Mycoplasma gallisepticum.