Цифровой анализ и количественная оценка изображений печеночных биоптатов

Ключевые слова: цифровой анализ, нейронная сеть, гепатит, фиброз печени, портальный тракт.

Введение

Цифровая медицина - это область медицины, которая использует мощности графического и центрального процессора компьютера в комбинации с методами визуализации для диагностики и разработки методов лечения различных нозологических форм. В настоящее время используются линзы цифровых микроскопов с высоким разрешением. Данные микроскопы позволяют сделать сканирование тканей и клеток, которые в последующем используются для анализа различными цифровыми инструментами. Одним из таких инструментов является алгоритм обработки изображение на основе нейронных сетей. 

Нейронная сеть – это упрощенная модель биологической нейронной сети, которая представляет собой совокупность искусственных нейронов, взаимодействующих друг с другом. Нейронная сеть является одним из направлений исследований в области искусственного интеллекта, которое основывается на попытках воспроизвести аналог аналитической системы головного мозга. Способность центральной нервной системы исправлять ошибки и обучаться должна позволить смоделировать работу человеческого мозга. В 1943 году Уоррен Мак-Каллок и Уолтер Питтс описали основные принципы работы нейронных сетей, в 1957 году Фрэнк Розенблатт разработал первую нейронную сеть. В 2010 году большое количество данных дало возможность использовать нейронные сети для машинного обучения [2]. Данные методики используются и в медицинских науках, таких как лучевая диагностика и патология, для классификации и интерпретации результатов методов визуализации.

Объектами нашего исследования являются цифровые изображения биоптатов печени. Печень - самая крупная железа пищеварительного тракта. В ней метаболизируются многие продукты обмена веществ, инактивируются гормоны, биогенные амины, лекарственные препараты. В печени синтезируются важнейшие белки плазмы крови: фибриноген, альбумины, протромбин и другие. Здесь метаболизируется железо и образуется желчь, необходимая для всасывания жиров в кишечнике. Большую роль она играет в обмене холестерина, являющимся важным компонентом клеточных мембран. В печени накапливаются жирорастворимые витамины - A, D, Е, К, необходимые для организма. В эмбриональном периоде печень является органом кроветворения. Многочисленные и важные функции печени определяют ее значение для организма как жизненно необходимого органа.

Печень – паренхиматозный дольчатый орган. Ее строма представляет собой соединительнотканную капсулу, которая плотно срастается с висцеральным листком брюшины и прослойками рыхлой волокнистой соединительной ткани, которые делят орган на дольки, образующие паренхиму. Долька печени представляет собой шестигранную призму, основу которой формируют гепатоциты. Двойной ряд гепатоцитов образует печеночную балку. Печеночные балки радиально сходятся к центральной вене и формируют дольку печени. Печеночные дольки образуют паренхиму и являются ее структурно-функциональной единицей. Во время слияния простых долек своими основаниями происходит формирование более крупных сложных печеночных долек. Их количество в печени человека может достигать 500 тыс. Междольковая соединительная ткань образует строму органа. В ней проходят кровеносные сосуды и желчные протоки, структурно и функционально связанные с печеночными дольками. Здоровая печень имеет слабо развитую междольковую соединительную ткань.  Интенсивное развитие соединительной ткани, сопровождающееся атрофией печеночных долек и утолщением соединительнотканных трабекул, является признаком патологического процесса в печени, которое называется «цирроз» [3,4]. Портальный тракт (ПТ) включает в себя дистальные ветви печеночной артерии, воротные вены и желчный проток – портальная триада, составляющая соединительную и лимфатическую ткани, которые окружает пограничная пластинка гепатоцитов. Помимо этого, в ПТ располагаются макрофаги и лимфоциты, единичные фибробласты. Увеличение количества иммунокомпетентных клеток является признаком воспаления. Со временем хроническое воспаление печени (гепатит) приводит к интенсивному развитию соединительной ткани в паренхиме.

По данным ВОЗ, около 325 миллионов человек в мире (4% всего населения), живут с хроническим гепатитом. На текущий момент, по оценкам экспертов ВОЗ, гепатитом В болеют около 260 млн человек, а гепатитом С — более 71 млн человек. По официальным данным Минздрава, в 2018 году в России числилось 916 884 больных с вирусными гепатитами. Смертность от вирусных гепатитов за последние 10 лет возросла почти в 1,5 раза [8]. Гепатиты делятся на группы в соответствии с их этиологией:

Вирусный гепатит - это состояние, при котором происходит поражение гепатоцитов вирусом, нарушается функция печени. Наиболее распространенными типами вирусов гепатита являются вирусный гепатит В и С. У пациентов с хронической инфекцией также может развиться цирроз печени - патология, при которой здоровая ткань печени замещается не функциональной рубцовой тканью (фиброз). У половины пациентов с циррозом, многочисленные рубцы в печени могут привести к печеночной недостаточности и трансплантации печени, а в некоторых случаях к развитию рака печени.

Aутоиммунный гепатит (АИГ) – хроническое заболевание печени, которое характеризуется перипортальным или более обширным воспалением, и протекает со значительной гипергаммаглобулинемией и появлением в сыворотке спектра аутоантител. Современные представления о патогенезе АИГ предусматривают взаимодействие факторов окружающей среды, нарушения механизмов иммунной толерантности и генетической предрасположенности. Это взаимодействие индуцирует Т-клеточные иммунные реакции против антигенов гепатоцитов, что ведет к развитию прогрессирующих некро-воспалительных и фибротических изменений в печени [5].

Первичный склерозирующий холангит (ПСХ) - хроническое холестатическое аутоиммунное заболевание печени, которое характеризуется диффузным воспалением и фиброзом внутрипеченочных, внепеченочных желчных протоков и ведущее в конечном итоге к развитию вторичного билиарного цирроза [6].

Первичный билиарный цирроз печени — хроническое аутоиммунное заболевание печени, которое протекает с холестазом, вызванным разрушением мелких внутрипеченочных желчных канальцев [20]. У пациентов с хроническим рецидивирующим воспалением печеночной ткани развивается фиброз, а в терминальной стадии - цирроз печени. У половины пациентов с циррозом многочисленные рубцы в печени могут привести к печеночной недостаточности и трансплантации печени, а в некоторых случаях к развитию рака печени.

Степени фиброза печени. Степень выраженности фиброза при хроническом заболевании печени отражает отдаленный прогноз и необходимость срочного лечения. Фиброз печени имеет 5 степеней: F0, F1, F2, F3, F4 (цирроз). При вирусном гепатите от стадии к стадии проходит около 5 лет, однако на поздних стадиях скорость прогрессирования фиброза выше. Скорость развития фиброза зависит от активности воспалительного процесса в печени. Существуют разнообразные методики для определения тяжести фиброза: биопсия, анализ крови, при котором измеряются показатели биохимических маркеров формирования фиброза. В настоящее время самым лучшим методом определения стадии фиброза печени считается эластометрия – прямое ультразвуковое определение плотности печеночной ткани. Плотности, полученные в результате измерений в нескольких точках (10-20) в кПа, соответствуют степеням фиброза по шкале МЕТАВИР от F0 – здоровая печень, до F4 – цирроз [18].

Результатом развития течения болезни может явится гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК). Для оценки состояния паренхимы печени при фиброзе (Metavir) и сохранности для трансплантации (степень стеатоза) в настоящее время используются полуколичественные и качественные методы, которые отличаются вариативностью между разными исследователями. Распространение технологии сканирования гистологических препаратов позволяет получать полный гистологический препарат в цифровом виде и производить его компьютерную обработку. Для оценки цифрового изображения используются различные виды программного обеспечения (ПО), одним их которых является QuPath [1]. Программа использует встроенные алгоритмы нейронных сетей для подсчета и классификации клеточного состава. ПО QuPath находится в свободном доступе и не требует материального вложения для его установки на персональный компьютер (ПК). Большинство существующих методов не позволяет провести объективную количественную оценку числа клеток в большом срезе биоптата и на всей его площади, что является существенным недостатком при количественной оценке пораженной площади биоптата.

Целью работы является предложить морфометрический инструмент, который мог бы проводить количественную оценку числа гепатоцитов и стромальных компонентов цифрового изображения биоптата печени.

Материалы и методы

4 оцифрованных биоптата на иммуностейнере BencMark ULTRA IHC/ISH “Ventana Medical System - Roche Diagnostics” были использованы для цифрового и количественного анализа. Патоморфологическое заключение соответствующих цифровых изображений биоптатов: вирусный гепатит С, гепатит в результате первичного склерозирующего холангита, аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз печени. Цифровой анализ изображений проводили с использованием программного обеспечения QuPath. Программное обеспечение было установлено на персональный компьютер MacBook Air 2020 с 1,1 GHz 2-ядерным процессором Intel Core i3, памятью 8 ГБ 3733 MHz LPDDR4X и графикой Intel Iris Plus Graphics 1536 МБ. Статистическую и математическую обработку полученных материалов проводили с использование MS Excel 2010. Для анализа цифровых изображений биоптатов было создано 10 классификаторов на основе продвинутых опций “Advanced option” и алгоритмах нейронных сетей программного обеспечения QuPath.

Результаты

Подход опирался на обучение классификаторов, которые должны выявлять гепатоциты и мезенхимальные клетки, обученные классификаторы в последующем применялись на исследуемых образцах. Использовались архивные микропрепараты ткани печени. Сканированные изображения гистологических срезов были получены с помощью сканера гистологических стекол, увеличение объектива 20. Было подготовлено 11 различных вариантов классификаторов, опирающихся на разные наборы признаков и функции “Random Tree” и “Boosted decision”. Создание классификаторов проводили на основании функции “Advanced Options” и внутренних алгоритмах нейронных сетей.

Методика цифрового анализа:

1. Загрузка оцифрованного гистологического препарата в ПО QuPath;

2. Выбор типов красителей, которые использовались при подготовке гистологического препарата для выставления направленности цветовых векторов ПО QuPath (изображено на рис. 1);

Рисунок 1. Выбор типа красителей гистологического препарата

3. Выделение анализируемой площади биоптата и подсчет количества клеток (изображено на рис.2);

Рисунок 2. Выделение анализируемой площади биоптата

4. Отсечение артефактов изображений (изображено на рис. 3);

Рисунок 3. Удаление артефактов изображения

5. Создание классификатора (изображено на рис. 4);

Рисунок 4. Создание выявляющих классификаторов

6. Подсчет выявленных типов клеток. Стромальный и паренхиматозный компонент (изображено на рис. 5);

Рисунок 5. Подсчет классифицированных клеток

Заключение

Предложен морфометрический инструмент для компьютерной оценки состояния паренхимы. Данный инструмент позволяет выделить особенности клеточного состава паренхимы и стромы. Использование данного инструмента может повысить качество гистологической диагностики при определении степени поражения печеночной ткани, как дополнительный метод оценки гистологического препарата.