Роль азотного питания в биосинтезе комплекса гидролитических ферментов микромицетом Aspergillus oryzae штамм 55

Пищеварение – это единая цепь процессов, которые осуществляются благодаря тесным взаимосвязям между деятельностью различных отделов пищеварительного тракта. При нарушении деятельности одного из отделов происходит нарушение функций и других отделов пищеварительной системы. Важную роль в пищеварении играют ферменты-гидролазы, каждый из которых имеет свое назначение. Так, протеазы участвуют в расщеплении белков до аминокислот, амилазы расщепляют поли- и олигосахариды до моносахаридов (глюкоза), липазы – жиры и липиды до моноглицеридов и жирных кислот. Одной из главных причин желудочно-кишечных заболеваний является дефицит вышеуказанных ферментов в организме человека. Например, на сегодняшний день не всегда удается подобрать правильную заместительную ферментную терапию больным с тяжелыми формами панкреатической недостаточности.

Важной нерешенной проблемой при создании лечебных препаратов, содержащих протеолитические ферменты, является тот факт, что большинство известных протеаз не устойчивы в кислой области, то есть при попадании в желудок они теряют свою активность. Этого недостатка лишена кислая протеаза – фермент, максимальная стабильность и каталитическая активность которого достигается именно в кислой среде при рН 2,0–5,0. Таким образом, этот фермент не только не разрушается в кислой среде желудка, а наоборот, максимально реализует свою биокаталитическую активность. К настоящему времени кислые протеазы уже используются в качестве активных компонентов во многих ферментных лекарственных препаратах [2; 3].

Способность к синтезу кислой протеазы обнаружена у некоторых бактерий и микромицетов. Например, перспективным продуцентом протеаз (кислых и нейтральных), а также α-амилазы и липазы является мицелиальный гриб Aspergillus oryzae, что открыло путь к их биотехнологическому получению.

Целью настоящей работы является изучение влияния азотсодержащих компонентов питательной среды на биосинтез кислой протеазы при глубинном культивировании гриба Aspergillus oryzae штамм 55.

Экспериментальная часть

Объектом исследования является микромицет Aspergillus oryzae штамм 55.

В экспериментах в качестве контрольной питательной среды (ПС) для культивирования гриба Aspergillus oryzae шт. 55 использовалась ПС следующего состава: глюкоза – 3%, крахмал – 3%, кукурузный экстракт – 3%, соевая мука – 2%, аммоний сернокислый – 0,2%, кальция карбонат – 0,3%, рН среды до стерилизации – 6,7–7,0. ПС разливали по 100 мл в колбы Эрленмейера (объемом 750 мл) и стерилизовали в автоклаве в течение 40 минут при 1,8 атм.

Культивирование продуцента с целью биосинтеза комплекса ферментов проводили на качалочной машине (200–220 мин^-1) при температуре 27±1°С в течение 72 часов.

Содержание кислой и нейтральной протеаз по окончании процесса ферментации определяли модифицированным методом Ансона, с использованием в качестве субстрата гемоглобина для кислой протеазы и 1% раствора казеина для нейтральных протезов, для определения α – амилазы использовали методики согласно ГОСТ Р 54330-2011. Оптическую плотность растворов определяли с помощью спектрофотометра (ПЭ – 5400ви) [1].

Для изучения влияния различных источников азотного питания в составе питательной среды на биосинтез ферментов кислой протеазы и α-амилазы была произведена замена соевой муки на ее гидролизаты, а также вводили в исходную ПС мочевину в концентрации 0,1%, 0,5% и 1,0% и такие минеральные источников азота, как нитрат натрия, нитрат аммония, гидрофосфат аммония и дигидрофосфат аммония в концентрациях 0,1%, 0,5% и 1,0%.

Результаты и их обсуждение

Известно, что повышения уровня биосинтеза ферментов можно достичь не только традиционными методами селекции или активно развивающимися в последние годы методами генетической инженерии микроорганизмов-продуцентов, но и за счет разнообразных способов получения посевного материала для глубинного культивирования, подбора состава питательных сред и продолжительности культивирования.

Важными компонентами питательных сред являются азот и углерод. Азот является одним из важнейших компонентов питания, поскольку необходим для биосинтеза белков и нуклеиновых кислот микробной клеткой. Для выбора условий культивирования необходимо также оптимизировать соотношение азота и углерода в составе питательных сред с тем, чтобы предотвратить снижение биосинтеза целевого продукта. При глубинном культивировании мицелиальных грибов источниками азота в питательной среде могут быть азот органических соединений и минеральные соли: соли азотной кислоты и аммонийные соли. В качестве органических источников азота применяются соевая мука, гидролизаты дрожжей и различные белки: казеин, желатин, бычий сывороточный альбумин и другие. Ранее было показано, что стимулирующий эффект на биосинтез протеаз может достигаться при введении в состав среды белков или продуктов их частичного гидролиза.

Полученные нами результаты показали, что замена соевой муки на ее гидролизаты не привела к увеличению биосинтеза кислой протеазы по сравнению с контрольными значениями, в то же время синтез α-амилазы снижается примерно в пять раз. Таким образом, можно сделать вывод, что гидролизаты соевой муки не оказывают стимулирующего действия на синтез комплекса ферментов грибом Aspergillus oryzae шт. 55, поэтому представляет интерес исследование воздействия гидролизатов других белковых веществ.

Внесение в питательную среду нитрата натрия в концентрациях 0,1%, 0,5%; нитрата аммония в концентрациях от 0,1% до 1% и мочевины в концентрации 0,1% также не способствовало биосинтезу комплекса ферментов. Кроме того, использование мочевины в качестве источника азота в концентрациях 0,5% и 1% ингибировало рост культуры.

Следует отметить, что нитрат натрия в концентрации 1,0% оказал стимулирующий эффект на биосинтез α-амилазы, увеличив активность фермента на 10±5%, однако негативно влиял на биосинтез кислой протеазы (активность кислой протеазы снизилась на 30±5%).

Введение в состав питательных сред минеральных солей гидрофосфатов аммония в концентрации 0,5% и 1% сопровождалось увеличением синтеза кислой протеазы на 20±5% и 90±5% соответственно. Биосинтез α –амилазы в этих вариантах увеличивался на 87±5% при содержании (NH₄)₂HPO₄ в ПС 0,5% и оставался на уровне контроля при наличии в ПС 1% (NH₄)₂HPO_4. Соль дигидрофосфат аммония в концентрации 0,5% способствовала увеличению активности кислой протеазы на 75±5% по сравнению с контрольными условиями, но при этом активность α-амилазы резко снизилась.

Вывод

·     Наличие в среде культивирования солей гидрофосфата аммония в концентрации 0,5% и 1% и дигидрофосфата аммония в концентрации 0,5% увеличило ферментативную активность кислой протеазы на 20±5, 90±5 и 75±5% соответственно. При этом наличие в среде соли гидрофосфата аммония в концентрации 0,5% способствует увеличению активность α-амилазы на 85±5%. Увеличение содержания гидрофосфата аммония до 1% и дигидрофосфат аммония в концентрации 0,5% снижают биосинтез кислой протеазы. Другие источники азота: гидролизаты соевой муки, мочевина, нитрат натрия и нитрат аммония, – не способствовали биосинтезу комплекса ферментов грибом Aspergillus oryzae шт.55.

·     Внесение солей дигидрофосфатов аммония в концентрации 0,5 и 1% и гидрофосфатов в концентрации 0,5% в составе среды культивирования с пониженным содержанием соевой муки увеличивает ферментативную активность кислой протеазы на 17±5%, 42±5% и 20±5% соответственно, однако, биосинтез α-амилазы при этом резко снижается.