ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА «ИММУНАЛ» НА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИММУНОСУПРЕССИИ

Введение. Возникновение и развитие многих заболеваний сопровождается нарушением иммунной системы организма, поэтому активно продолжается поиск новых лекарственных и профилактических средств, особенно растительного происхождения, для восстановления функциональной активности иммунной системы. Перспективным сырьем для разработки таких препаратов является препарат Иммунал, относящийся к иммуностимуляторам растительного происхождения. В основе Иммунала лежит трава эхинацеи пурпурной, накапливающая, в соответствии с данными литературы, большой комплекс биологически активных веществ полифенольной природы, органические кислоты, витамины, микроэлементы антоцианы, флавоноиды, полифенолы, и другие биологически активные вещества. Известно, что фенольные соединения растений обладают иммунорегуляторным действием, механизм которого может заключаться в иммунокорригирующем действии в условиях цитостатической иммуносупрессии и в регуляции синтеза про- и противовоспалительных цитокинов[5, с.2]. Существенным достоинством таких препаратов является их слабая токсичность для человека и совокупное действие комплекса биологически активных веществ, оказывающих комплексное воздействие на организм в целом.

Цель и задачи исследования. Оценка влияния препарата Иммунал на гематологические показатели у мышей при экспериментальной иммуносупрессии.

Для достижения поставленной цели, были решены следующие задачи:

1. Создание модели экспериментальной имунодепрессии.

2. Оценка влияния препарата Иммунал на гематологические показатели экспериментальных животных.

Материалы и методы. Объект исследования – препарат Иммунал. Эксперимент проводился на 60 беспородных мышах-самцах массой 20-30 г., полученных из питомника РАМН «Рапполово». Изучение иммуномодулирующей активности препарата Иммунал проводилось на модели иммуносупрессии, которая создавалась цитостатиком Mетотрексат («Сандоз», Словения; лекарственная форма – раствор для инъекций).

Результаты.  Животные были разделены на 4 группы по 15 особей: 1 – получавшие воду, контрольная; 2 – «Иммунал» 5 мл/кг; 3 – Mетотрексат 10 мг/кг; 4 – Mетотрексат и «Иммунал».

Метотрексат вводили однократно в первый день эксперимента, «Иммунал» мыши получали трижды на протяжении следующих трёх дней: через 1 час, 24 часа и 48 часов после однократного введения Mетотрексата.

Все мыши выводились из эксперимента на 4-е сутки под эфирным наркозом. Эксперименты проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г.), «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей», «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств».

На первом этапе проводили оценку массы мышей путём прямого взвешивания, результат выражали в граммах, после чего у животных производили забор крови для определения следующих параметров:

1. Количественное определение содержания гемоглобина в крови проведено спектрофотометрически (EcoView УФ-1200, длина волны 540 нм)) гемиглобинцианидным способом - метод Drabkin («Гемоглобин Агат, ООО «Агат-Мед).

Расчет концентрации гемоглобина в крови проводили по формуле:

где:  С – концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

Eо – оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.;

Eк – оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;

120 – концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л

2. Количество лейкоцитов оценивалось с помощью микроскопии в камере Горяева после разведения исследуемой крови мышей в 20 раз 5% раствором уксусной кислоты с метиленовым синим. Подсчет лейкоцитов проводили в 100 больших квадратах, результат выражали в х10^9/л крови.

3. Оценку лейкоформулы – подсчёт субпопуляций проводился методом микроскопирования в мазках крови, окрашенных по Романовскому – Гимзе.

4. Статистическая обработка результатов проводилась в программе Statisticа 9.0, результаты выражали в виде среднего и ошибки среднего, различия определяли по t-критерию Стьюдента.

В результате проведенного исследования влияния препарата Иммунал на массу животных и гематологические показатели периферической крови мышей, установлено что применение препарата Иммунал и Mетотрексат а в указанных дозировках не сопровождалось гибелью экспериментальных животных. Были получены следующие результаты, на основании которых были составлены графические модели:

Оценка массы животных: По отношению к контрольной группе, ведение препарата Иммунала не изменяло массу экспериментальных животных, введение Метотрексата достоверно снижало массу животных, применение препарата Иммунала на фоне введения Метотрексата достоверно приводило к восстановлению массы животных до уровня контрольной группы.

Рисунок 1. Оценка массы животных

Оценка гемоглобина: по сравнению с контрольной группой, введение препарата Иммунала не имело влияния на концентрацию гемоглобина в периферической крови, введение Метотрексата достоверно снижало этот параметр, применение Иммунала на фоне введения Метотрексата достоверно приводило к восстановлению концентрации гемоглобина в крови мышей до уровня контрольной группы.

Рисунок 2. Оценка гемоглобина

Оценка количества лейкоцитов: применение Иммунала без Метотрексата и на фоне его введения не изменяло показатели количества лейкоцитов по сравнению с контрольной группой.

Рисунок 3. Оценка количества лейкоцитов

Подсчёт лейкоцитарной формулы: Сравнивая с контрольной группой, при подсчете лейкоцитарной формулы был отмечено увеличение процента содержания моноцитов у животных 4 группы при введении Иммунала на фоне супрессии Метотрексатом.

Рисунок 4. Подсчёт лейкоцитарной формулы

При подсчёте абсолютного количества лейкоцитов выявлены следующие изменения: применение цитостатика Метотрексата достоверно уменьшало количество сегментоядерных нейтрофилов, лейкоцитов, моноцитов, по сравнению с контрольной группой.

Применение Иммунала на фоне иммуносупрессии Метотрексатом имело тенденцию к восстановлению количества сегментоядерных нейтрофилов, лейкоцитов, моноцитов, до уровня контрольной группы.

Таблица 1.

 Подсчёт абсолютного количества лейкоцитов

Таким образом, анализируя полученные результаты, установлено, что введение Иммунала 5 мл/кг не приводило к достоверным различиям показателей экспериментальных животных с контрольной группой животных. Важно отметить, что введение препарата Иммунал приводило к восстановлению изучаемых гематологических параметров на фоне введения Метотрексата, что отражает чувствительность компонентов периферической крови к биологически активным веществам эхинацеи. Препараты цитостатики часто используются в терапии аутоиммунных заболеваний, Метотрексат является одним из базисных препаратов в лечении ревматоидного артрита. Метотрексат проявляет цитотоксическое и иммунодепрессивное влияние за счет индуцирования оксидативного стресса и активации свободнорадикального окисления. Окислительный стресс возникает, когда баланс между активными формами кислорода и антиоксидантами нарушается, что приводит к нарушению регуляции клеточных функций и развитию различных патологических состояний[4, с.68].

Свободные радикалы снижают активность антиоксидантных ферментов и вызывают перекисное окисление липидов клеточных мембран, в том числе и у субпопуляций периферических лимфоцитов, и как следствие каскад реакций, приводящих к повреждению ДНК и апоптозу[2, с.23]. Эффект Иммунала вероятен благодаря предотвращению ПОЛ, поддержанию эндогенных антиоксидантных молекул и сверхэкспрессии генов, кодирующих антиоксидантные ферменты, тем самым предотвращая повреждение ДНК. Этот эффект, по-видимому, опосредован природными антиоксидантами (антоцианы, флавоноиды, полифенолы, витамин С и др.), которые значительно ослабляют окислительную угрозу и приводит к нормализации показателей[1,с.408].

Выводы:

Учитывая вышесказанное, подавление действия Метотрексата является следствием действия активации биологических веществ эхинацеи пурпурной, приводящих к восстановлению гематологических параметров периферической крови экспериментальных животных. Иммунал является перспективным препаратом для поддерживающей терапии в лечении аутоимунных заболеваний с применением иммуносупрессантов, способствуя восстановлению гематологических параметров периферической крови и предотвращая появление осложнений в виде нарушений костномозгового кроветворения[3,с.52].