ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭКСТРАКТА GALLERIA MELLONELLA (ВОСКОВАЯ МОЛЬ) НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ

STUDY OF THE EFFECT OF GALLERIA MELLONELLA (WAX MOTH) EXTRACT ON THE PROLIFERATIVE AND FUNCTIONAL ACTIVITY OF LYMPHOID CELLS IN THE BLOOD OF HEALTHY DONORS

Volchek Igor Anatolyevich

Doctor of Medical Sciences, Professor, Medical Institute of Continuing Education, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Russian Biotechnological University (ROSBIOTECH)", Russia, Moscow

Аннотация. Рассмотрены вопросы механизмов иммуномодулирующего эффекта продукта пчеловодства, экстракта Galleria Mellonella (восковая моль).

Abstract. The issues of mechanisms of immunomodulatory effect of beekeeping product, Galleria Mellonella extract (wax moth) are considered.

Ключевые слова: экстракт Galleria Mellonella, пролиферация лимфоцитов, маркеры лимфоцитов цитокины.

Keywords: Galleria Mellonella extract, lymphocyte proliferation, cytokine, lymphocyte markers.

Актуальность. Мед и другие продукты пчеловодства на протяжении веков занимают важное место как в народной, так и в академической медицине, в частности, в контексте регуляции иммунологического гомеостаза. Иммуномодулирующие свойства прополиса, натурального меда и производных на его основе, включая лекарственные формы (в том числе инъекционные), получили достаточное научное подтверждение [1; 3].

В то же время, сведения об иммунологических механизмах действия продуктов жизнедеятельности Galleria Mellonella (восковой моли), тесно связанной с ульем, остаются крайне ограниченными.

Цель настоящей работы — охарактеризовать иммуномодулирующие свойства экстракта Galleria Mellonella в культуре мононуклеарных клеток человека in vitro.

Материалы и методы. В исследовании были использованы мононуклеарные клетки (МНК) крови 19 здоровых доноров (11 мужчин и 8 женщин в возрасте  25–42 лет),  выделенные из крови градиентным центрифугированием.

В качестве препарата тестирования использовали любезно предоставленный АНО «Агентство по развитию пчеловодства Приморского края» 20 % экстракт — продукт жизнедеятельности восковой моли (ПЖВМ).

МНК в концентрации 2 x10⁶/мл культивировали в течение 36 ч. в присутствии неспецифического митогена–ФГА (фитогеммаглютинин Р, PHA P, Sigma) и различных концентраций ПЖВМ (10 мкг/мл; 5 мкг/мл; 1 мкг/мл).

В контрольных пробах клетки культивировали либо в среде (без ФГА и ПЖВМ), либо присутствии только ФГА или ПЖВМ. 

По окончании культивирования определяли следующие параметры:

Поверхностные маркеры клеток методом проточной цитофлюориметрии:  CD4+, CD8+, CD4+CD45RO+, CD8+CD45RO+, CD4-CD45RO+, CD8-CD45RO+.

Пролиферативный ответ клеток  по включению в ДНК  радиоактивной метки (H³ –тимидин).

Цитокины в культуральных супернатантах: фактор некроза опухоли —альфа (ФНО-альфа), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и интерферон-альфа (ИФН-альфа). Цитокины определяли с использованием иммуноферментных тест-систем производства компании «Вектор-Бест» (Новосибирск).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием парного критерия Стьюдента (Student).

Результаты. Соотношение различных субпопуляций Т-лимфоцитов, участвующих в иммунном ответе, является ключевым фактором, определяющим его силу и направленность [2].

В рамках данного исследования, как показано в Таблице 1, воздействие ПЖВМ не привело к статистически значимым изменениям в содержании CD4+ Т-клеток в митогенактивированной лимфоидной популяции.

Таблица 1.

Процентное содержание  CD4+ Т-лимфоцитов

ПЖВМ также не оказывал значимого влияния на содержание CD4+CD45RO+ хелперных Т-лимфоцитов в митоген-активированной клеточной популяции. Эти лимфоциты ответственны за долговременную иммунную память [5; 6], что и показано в таблице 2.

Таблица 2.

Процентное содержание  CD4+СD45RO+ Т-лимфоцитов

Полученные данные позволяют предположить, что ПЖВМ не влияет на процентное содержание CD4+ Т-лимфоцитов (хелперов) в популяции.

Известно, что противовирусный иммунный ответ формируется благодаря CD8+ Т-лимфоцитам [2].

Влияние ПЖВМ на содержание CD8+ и CD8+RO+ Т-лимфоцитов показано в таблицах 3 и 4.

Таблица 3.

Процентное содержание  CD8+ Т-лимфоцитов.

Таблица 4.

Процентное содержание  CD8+CD45RO+ Т-лимфоцитов

Таким образом, согласно полученным данным, ПЖВМ не оказывал существенного влияния на процентное содержание CD8+/RO+ и CD8+/RO- Т-лимфоцитов в митоген-активированной клеточной популяции.

С другой стороны, выявлено самостоятельное влияние ПЖВМ (в отсутствие митогена)  на содержание  цитотоксических Т-лимфоцитов в лимфоидной популяции.

Как следует из представленных данных, в присутствии ПЖВМ имело место более чем двукратное достоверное увеличение содержания  СD8+ Т-клеток  и четырехкратное увеличение  CD8+CD45RO+ Т-клеток (P < 0.05).

Как известно, воспалительная реакция является неотъемлемой частью иммуногенеза [4].

Избыточность или недостаточность воспаления играют значимую роль в патогенезе многих заболеваний, а ФНО-альфа и ИЛ-6–цитокины, в значительной степени определяющие степень воспаления.

Данные, характеризующие влияние ПЖВМ на продукцию этих цитокинов, представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5.

Содержание ФНО-альфа (пг/мл) в культуральных супернатантах

Полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемое соединение (ПЖВМ) обладает статистически значимой способностью (P <0.05) подавлять продукцию ФНО-альфа митоген-активированными мононуклеарными клетками.

Таблица 6.

Содержание  ИЛ-6 (пг/мл) в культуральных супернатантах

Из представленных данных следует, что ПЖВМ не оказывал статистически значимого влияния на продукцию ИЛ-6, осуществляемую митоген-активированными мононуклеарными клетками человека.

Как известно, ИФ-альфа играет ключевую роль в противовирусной защите организме [2]. Проведенные исследования показали разнонаправленное влияние ПЖВМ на продукцию ИФ-альфа мононуклеарными клетками от различных доноров с колебаниями от выраженного эффекта до его полного отсутствия. В этой связи однозначного вывода относительно действия ПЖВМ на синтез интерферона альфа сделать не представляется возможным. Данный вопрос требует дальнейшего глубокого изучения.

Пролиферативный ответ лимфоидных клеток служит суммарным показателем иммунотропной эффективности вещества [2].

Влияние ПЖВМ на лимфоидную пролиферацию детализировано в таблице 7.

Таблица 7.

Влияние ПЖВМ на лимфоидную пролиферацию

Таким образом, экстракт Galleria Mellonella (восковая моль) обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами.

Основные результаты, полученные в данном исследовании, приведены ниже.

Стимуляция пролиферации лимфоцитов. Полученные данные свидетельствуют о том, что ПЖВМ обладает выраженной способностью стимулировать пролиферацию лимфоцитов, сравнимой с действием ФГА (фитогемагглютинина). Примечательно, что совместное применение ФГА и ПЖВМ не приводило к суммированию их эффектов на пролиферацию.

Активация лимфоцитов. Результаты исследования предполагают, что ПЖВМ является активатором лимфоцитов. Его иммунотропная противовирусная активность, вероятно, обусловлена самостоятельной способностью избирательно увеличивать содержание CD8+RO- и CD8+RO+ Т-клеток в популяции лимфоцитов.

Влияние на интерфероны. На данный момент не получено данных, указывающих на то, что ПЖВМ является индуктором интерферона-альфа (ИФ-альфа). Тем не менее, взаимосвязь ПЖВМ с синтезом и действием интерферонов I типа требует дальнейшего изучения.

Супрессия ФНО-альфа. Согласно полученным данным, ПЖВМ способен подавлять выработку фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа) активированными иммунокомпетентными клетками. Ингибирование продукции ФНО-альфа может лежать в основе противовоспалительного действия ПЖВМ.

Парадоксальное повышение ФНО-альфа. Интересно, что в культурах мононуклеарных клеток, активированных ПЖВМ самостоятельно (без ФГА), были выявлены повышенные концентрации ФНО-альфа.

Нормализация воспалительных процессов. В целом, полученные данные позволяют предположить, что ПЖВМ может оказывать нормализующее действие на воспалительные процессы. Однако это предположение требует дальнейших экспериментальных подтверждений.

Выводы:

ПЖВМ не оказывает значимого влияния на относительное содержание CD4+RO- и CD4+RO+ Т-клеток в популяции лимфоцитов, активированной митогенами.

ПЖВМ способен самостоятельно увеличивать относительное содержание CD8+RO- и CD8+RO+ Т-клеток в популяции лимфоцитов, активированной митогенами.

ПЖВМ способен ингибировать продукцию ФНО-альфа клетками.

ПЖВМ не оказывает существенного влияния на клеточную продукцию интерлейкина-6 (ИЛ-6).

ПЖВМ, вероятно, не является интерфероногеном.

ПЖВМ обладает выраженными митогенными свойствами по отношению к лимфоцитам.

Полученные данные свидетельствуют о наличии у ПЖВМ выраженных иммуномодулирующих свойств, которые отличают его от других иммунотропных препаратов.