Помощь определения местоположения микробиома при картировании в определении его роли

Для микроба местоположение - это все. Такие факторы, как температура, а также доступ к воде и питательным веществам, определяют, какие виды микробов могут процветать в конкретном месте. Секвенируя микробную ДНК, исследователи открыли обширные и ранее непризнанные микроскопические миры, выявляя микроорганизмы, живущие в разных местах - от почвы и метро до насадок для душа и закваски. Исследователи каталогизировали микроорганизмы, живущие на теле человека и в его организме, будь то микробная «пустыня» на тыльной стороне ладони, «пышный микробный лес» подмышечной впадины или микробные «джунгли» рта.

Рисунок. Структура зубного налёта

Исследователи находят достаточную пространственную структуру в оральном микробиоме. На этой структуре зубного налета, которая по внешнему виду называется «еж», видны несколько родов бактерий: Corynebacterium (пурпурный), Porphyromonas (голубой), Streptococcus (зеленый) и Haemophilus/Aggregatibacter (оранжевый).

Но это предел, до которого доходит секвенирование. Оно может позволить исследователям сравнить обитателей «тропического леса» с обитателями «пустыни», но не покажет, где каждый микроб находится в экосистеме. Знание деталей местоположения может показать, с кем и как взаимодействуют эти микробы. Как у любого макроорганизма, физическое местоположение микроба в системе объясняет его экологическую роль

За последние несколько лет благодаря достижениям в технологии визуализации исследователи получили первое представление о том, где именно живут отдельные микробы. Они делают снимки целых микробиомов - например, во рту - с подробностями вплоть до уровня отдельных клеток, выявляя сообщества, которые располагаются в определенном порядке. «В микробиоме полости рта мы обнаруживаем удивительное количество пространственной структуры», - говорит Джессика Марк-Уэлч, биолог из Морской Биологической Лаборатории (MBL) в Вудс-Хоуле, штат Массачусетс. «Эти бактериальные сообщества организованы гораздо более высоко, чем мы предполагали».

Точное картирование микробиома по-прежнему является новой областью исследований, но такие снимки уже дают исследователям возможность задавать новые вопросы о том, как микробы взаимодействуют и работают вместе, и отвечать на них. Это позволит не только лучше понимать вселенную микроорганизмов, но может привести к улучшению здоровья людей и состояния окружающей среды.

Архитектурный интерес

Карта микробиомов, созданная Марком-Уэлчем и его коллегами, напоминает произведение искусства. Пурпурные полосы разветвляются наружу и на концах  перемежаются зелеными пятнами. В промежутках между ними смешиваются голубые и оранжевые мазки. Каждый цвет представляет различный род бактерий, вместе образующих смешанное микробное сообщество зубного налета, трехмерную структуру, которую Марк-Уэлч и Гари Бориси, биолог из Института Форсайта в Кембридже, штат Массачусетс, назвали «ежом» за его сходство с щетинистым животным.

Изображение ежа содержит несколько цветовых кодов бактерий. Никто не знает всех деталей того, как эти микробы взаимодействуют и почему. Что ясно, так это то, что их расположение не случайно. Например, анаэробные бактерии, которым для метаболизма не нужен кислород, собираются в центре сообщества микробов, в то время как аэробные роды располагаются снаружи, где доступа к кислороду больше. Бактерии, которые производят такие соединения, как лактат, находятся рядом с другими, которые этот лактат потребляют.

Обнаружение этого удивительного паттерна, опубликованного в 2016 году, стало успехом технологии CLASI-FISH, которую Бориси помогал разрабатывать в течение нескольких лет, будучи директором Морской Биологической Лаборатории (2). Этот метод основан на хорошо известной методике, называемой флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH - fluorescence in situ hybridization), которую исследователи использовали в прошлом для маркировки конкретной бактерии флуоресцентным красителем путем нацеливания на её РНК.

В стандартной FISH исследователи используют цветовые фильтры для выявления микробов, которые светятся красным, синим или зеленым цветом. Но с «комбинаторной маркировкой и спектральной визуализацией» CLASI-FISH (CLASI - combinatorial labeling and spectral imaging) Борис и Марк-Уэлч вместо этого используют детектор для измерения всего спектра флуоресцентного красителя. Это дает им возможность различать несколько оттенков красного, например, предоставляя более широкую палитру, чтобы видеть больше типов бактерий одновременно. Используя мощный микроскоп, Борис и Марк-Уэлч могут идентифицировать около дюжины родов бактерий в одном изображении. «Удивительно, сколько во рту не было видно, - говорит Марк-Уэлч. «Это действительно потому, что только сейчас у нас есть технология, чтобы это увидеть».

Совсем недавно исследователи изучили человеческий язык и внутреннюю поверхность щеки, результаты которых им еще предстоит опубликовать. Изображения на языке выявили виды бактерий и микробные конфигурации, отличающиеся от того, что находится в зубном налете. Но эти виды были так же организованы - настолько, что микробы выглядели как единое целое, как если бы каждая бактериальная клетка была организована - как клетки в печени или поджелудочной железе. По словам Бориси, эта сплочённая группа из нескольких типов клеток предполагает собой то, что микробное сообщество может «действовать согласованно, внося свой вклад в нормальную физиологию своего хозяина». «Можно подумать, что вы смотрите на орган тела», - говорит он.

В прошлом году исследователи начали делать снимки стерильных мышиных кишечников, которые были заселены 15 видами бактерий, чтобы имитировать кишечник человека. Микрофлора кишечника связана с целым рядом патологий, от болезни Крона и хронического язвенного колита до колоректального рака. Однако, в отличие от полости рта, микрофлора кишечника не так самоорганизуется, вместо этого она демонстрирует большее смешение между бактериальными типами. «Возможно, это происходит, потому что нет постоянных поверхностей, таких как зубы и языки, за которые можно цепляться», - говорит Марк-Уэлч.

Но это не означает, что кишечный микробиом является случайной бактериальной смесью. Микробы все еще организованы в зависимости от того, где они находятся. Например, сообщества в тонком кишечнике намного больше  приспособлены к метаболически более быстрой и преходящей жизни, чем сообщества в толстом кишечнике. В толстой кишке микробный состав меняется от просвета кишки в сторону стенок слизистой оболочки. Некоторые бактерии фактически потребляют слизь.

Джастин Зонненбург, биолог из Стэнфордского университета, с помощью методов FISH показал, что эти бактерии и их близость к слизистой оболочке кишечника могут быть важны для понимания здоровья человека (4). Многие из микроорганизмов в нижних отделах ЖКТ потребляют волокна, которые не может переварить пищеварительная система человека. Но при потреблении человеком малого количества пищевых волокон они начнут потреблять слизь. Этим микробы истощают слизистую оболочку, обнажая эпителиальный слой стенки кишки, что ведет к развитию воспаления и заболевания. «Пространственная организация между просветом и поверхностью слизистой оболочки имеет первостепенное значение для понимания этого процесса», - говорит Зонненбург.

Команда Зонненбурга также концентрируется на крошечных полостях вдоль внутренней стенки кишки, называемых криптами, в которых находятся стволовые клетки (5). Крипта также защищает микробное сообщество. «Когда микроорганизмы попадают туда, вытеснить их оттуда становится очень тяжело», - говорит Зонненбург. Бактерии, колонизировавшие крипту, могут диктовать микрофлорой всего кишечника. Тем не менее, исследование на мышах, проведенное его командой в этом году, показало, что ключевой микроорганизм в микробном сообществе крипты можно заменить внедрением иного, более предпочтительного штамма этого же микроорганизма, если избирательно кормить мышей пищей, более предпочитаемой новым штаммом (в исследовании использовался тип морских водорослей) и, следовательно, перепрограммировать микрофлору кишечника для лечения заболевания.

Микробиомы в движении

Хотя основанные на FISH методы обеспечивают беспрецедентные изображения микробных сообществ, они предлагают только неподвижные кадры. Рагхувер Партхасарати, биофизик из Университета штата Орегон, вместо этого использует технику, называемую лучевой микроскопией (7), которая позволяет ему наблюдать, как сообщество изменяется в живом кишечнике в пространстве и времени.

В частности, Партхасарати изучает кишечник живых рыбок данио через прозрачное тело животного. Исследователи заселяют рыбок данио микробами, сконструированными для получения флуоресцентных белков. Затем они используют лазеры для формирования луча, который возбуждает белки, создавая двухмерное изображение светящихся микроорганизмов, или, сканируя кишку, создают трехмерное изображение. Метод достаточно быстр, чтобы исследователи могли зафиксировать, как микробы перемещаются по кишечнику.

Чтобы изучить основные принципы взаимодействия микробов друг с другом и хозяином, команда Партхасарати заполняет стерильную кишку рыбок данио только парой видов. Например, в исследовании, опубликованном ранее в этом году, они показали, как вирус холеры может проникает в своего хозяина (8). После заселения в ином случае стерильной кишки рыбок данио бактерией Aeromonas veronii исследователи инфицировали рыбок вирусом холеры, обнаружив, что вирус заставляет кишку сокращаться, что ведет к удалению бактерии и позволяет вирусу получить контроль.

Исследователи только начали изучать, как микробы расположены в пространстве и времени, и хотят выяснить, куда их могут привести новые методы, такие как CLASI-FISH. Даже базовые системы, такие как тонкие бактериальные пленки или микробиомы у червей, могут вызвать новые гипотезы и идеи. «Есть такие системы, которые напрашиваются на то, чтобы быть изученными», - говорит Партхасарати. «У нас уже есть инструменты для их изучения, нам просто нужно погрузиться в работу и сделать это».

Действительно, эти инструменты для исследования микробиомов применимы ко всем видам окружающей среды. «Цель состоит не в том, чтобы быть слишком сосредоточенным на кишечнике, а в том, чтобы использовать его в качестве шаблона», - говорит К. Хуанг, биофизик из Стэнфордского университета.

В настоящее время Марк-Уэлч использует CLASI-FISH для картирования микробной структуры на морском пластике и водорослях. По ее словам, из-за большого количества пластика в океанах микробные сообщества, которые живут на пластике, могут воздействовать на морскую среду и животных, которые проглатывают пластик. Также возможно использование этих микроорганизмов для уничтожения отходов. Понимание того, как микробы организованы на пластике, может быть полезным

Между тем, водоросли были предложены в качестве источника биотоплива, и понимание того, как они взаимодействуют со своим микробиомом, может помочь сохранять выращенные водоросли здоровыми и сделать такие экспериментальные предприятия более жизнеспособными. Марк-Уэлч и ее сотрудники начали делать снимки микробиомов на пластике и водорослях. Хотя еще слишком рано знать, будет ли такая работа плодотворной, важно, чтобы бактериальные сообщества были буквально на виду.

«Мы на удивление мало знаем о пространственной организации в этих многовидовых микробных системах», - говорит Партхасарати. «Мы едва знаем, какие вопросы нам следует задавать. Это прекрасное время для изучения ».