Оптимизация питательной среды для культуры мицелиального гриба Aspergillus oryzae

Введение

В последнее время в мире, и в нашей стране в частности, возрастает рост заболеваний, связанных с желудочно-кишечным трактом. Одной из часто используемых групп препаратов в области гастроэнтерологии при нарушениях переваривания и всасывания пищеварительных веществ являются ферментные препараты [6].

Фармацевтический рынок РФ на данный момент нуждается в расширении ассортимента предлагаемых отечественных мультиферментных препаратов, это определяет актуальность создания лекарственного препарата на основе микробных ферментов гриба Aspergillus oryzae – продуцента амилолитических и протеолитических ферментов. Важная проблема ферментных препаратов состоит в том, что многие ферменты не устойчивы в кислой области рН и при попадании в желудок теряют свою активность.

Этого недостатка лишена кислая протеаза, ее стабильность и активность достигается при рН 2,0–5,0, таким образом, этот фермент активно действует в кислой среде желудка [4, 5].

На сегодняшний день очень актуален вопрос о путях повышения активности ферментов мицелиального гриба в промышленных условиях. Ферментативная активность зависит как от природы самого продуцента БАВ, так и от условий культивирования. Одним из путей повышения биосинтеза является проведение оптимизации процесса культивирования, в частности оптимизация состава питательной среды. Питательная среда является определяющим условием для развития микроорганизма и синтеза БАВ.

В состав среды культивирования должны входить все необходимые источники питания в доступной для продуцента форме [4].

Целью исследования является получение высокого уровня биосинтетической активности комплекса ферментов мицелиального гриба Aspergillus oryzae штамм 55 путем проведения оптимизации состава питательной среды по 3 факторам.

Экспериментальная часть

В качестве объекта исследований использовалась культура микромицета Aspergillus oryzae   штамм 55. Для исследования была выбрана среда следующего состава: глюкоза – 3 %, крахмал – 3 %, кукурузный экстракт – 3 %, соевая мука – 2 %, аммоний сернокислый – 0,2 %, кальция карбонат – 0,3 %. Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве в течение 40 минут при 1,8 атм. В качестве посевного материала используется суспензия спор культуры гриба, выросшего в пробирке на скошенном сусло-агаре.

Культивирование проводили глубинным способом в колбах Эрменмейэра (750 мл) при температуре 27±1 ⁰С в течение 72 часов.

По окончании процесса культивирования определяли ферментативную активность кислой протезы с использованием модифицированного метода Анона [2] и α-амилазы – согласно ГОСТ Р 54330-2011 [3].

В настоящей работе использовали метод математического планирования экспериментов для оптимизации питательной среды, который позволяет существенно сократить число проводимых опытов.

Используя схему ортогональных прямоугольников в экспериментальную матрицу закладывались основные факторы на разных уровнях, в качестве основных факторов выступали компоненты питательной среды: глюкоза, пшеничные отруби и калий фосфорнокислый двузамещенный, в качестве уровней – их различные концентрации. Критерием оптимизации служила активность протеолитических и амилолитических ферментов в глубинной культуре [1].

Значения концентраций компонентов варьировали по данным Таблицы 1, при этом была произведена замена крахмала на пшеничные отруби, а также в питательных средах присутствовали соли магния, железа и калия.

Таблица 1. 

Матрица планирования эксперимента

Эффект биосинтетической активности ферментов рассчитывали для каждого фактора каждого уровня и определяли их оптимальные значения (табл. 2)

Таблица 2.

Зависимость эффектов активности ферментов от концентрации компонентов питательной среды

По расчету эффектов для биосинтетической активности кислой протеазы и α-амилазы можно сделать вывод, что все 3 фактора являются значимыми и оказывают влияние на ферментативную активность. Для глюкозы и пшеничных отрубей оптимальными значениями концентрации для комплекса ферментов оказались 1 % и 2 % соответственно. Оптимальным значением калия фосфорнокислого двузамещенного для биосинтетической активности кислой протеазы – 1,75 %, в то же время при этой концентрации достигается минимум для биосинтетической активности α-амилазы.

Таким образом, на основании проведенных экспериментов предложена оптимизированная питательная среда для биосинтеза комплекса ферментов кислой протеазы и α-амилазы культурой Aspergillus oryzae штамм 55.

Вывод

· Проведено исследование, в ходе которого определен оптимальный состав питательной среды для культивирования микромицета Aspergillus oryzae штамм 55;

· Показано, что применение оптимизированной питательной среды приводит к получению повышенного содержания комплекса ферментов.