Потенциальная роль аденозин – дезаминазы – 2 в диабетической ретинопатии

POTENTIAL ROLES OF ADENOSINE DEAMINASE-2 IN DIABETIC RETINOPATHY

Diana Titaeva

Student of Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Orenburg state medical university, Russia, Orenburg

Vladislava Arkhipova

Student of Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Orenburg state medical university, Russia, Orenburg

Ekaterina Borovskaya

Scientific director, Assistant of the department of Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Orenburg state medical university, Russia, Orenburg

Аннотация. Экспериментально определено увеличение экспрессии и активности аденозин-дезаминаза -2 в сетчатке человека и свиньи с диабетом, а также у гликозилированного альбумина Амадори (AGA) - или гипергликемии в обработанной микроглии свиньи и человека. Эти результаты предполагают, что воспаление сетчатки, при диабетической ретинопатии опосредовано с аденозин-дезаминаза -2.

Abstract. The  increase in the expression and activity of adenosine deaminase -2 in the retina of humans and pigs with diabetes, as well as in glycosylated albumin Amadori (AGA) or hyperglycemia, in treated pig and human microglia was experimentally determined. These results suggest that retinal inflammation in diabetic retinopath is mediated with adenosine deaminase -2.

Ключевые слова: Диабетическая ретинопатия; ингибитор аденозинкиназы;  аденозин деаминаза-2.

Keywords: Diabetic retinopathy; аdenosine kinase inhibitor; аdenosine deaminase-2.

Цель: изучения роли аденозина-дезамины- 2 в развитии осложнений при диабетической ретинопатии

Метод:  Клиническое исследование посмертных образцов глаза у лиц с диабетом и без. Проведение вестерн-блот анализа с сетчатками свиней, страдающих диабетом и реакции ПЦР в реальном времени. А также изучения влияния лекарственной терапии и лечения гипоксии на культивируемые  клетки микроглии.  Все подсчеты проводились с помощью компьютерной программы. Диабетическая ретинопатия является основной причиной слепоты среди взрослого трудоспособного населения. Аденозинергическая система рассматривается как значительный модулятор нейротрансмиссии и воспалительного ответа посредством действий четырех типов рецепторов (А1R,  A2AR,  A2BR,  A3R). Описанные ниже экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что на эту систему  в значительной степени влияют диабетические условия и что модуляция ее компонентов может выявить потенциальные терапевтические мишени для лечения диабетической ретинопатии, особенно на ранних стадиях заболевании.[6, стр.1]. На ранних стадиях заболевания, решающее значения в развитии основных осложнений диабетической ретинопатии играет активация микроглии сетчатки.

Аденозин – пуриновый нуклеотид, повышен в местах повреждения тканей в результате воспаления или гипоксии. Путь удаление аденозина с помощью аденозин-дезаминазы-1 играет незначительную роль в регуляции аденозинергической функции; основная роль аденозин-дезаминазы-1заключается в поддержании низкого уровня 20-деоксиаденозина для правильного функционирования иммунной системы клетки. Так же кроме аденозин-дезаминазы -1 был обнаружен аденозин – дезаминаза – 2 у млекопитающих, низших позвоночных, насекомых как внеклеточный фермент. Во время воспалительного процесса происходит непропорциональное увеличение аденозин – дезаминаза – 2. Обнаруживается в тканях, богатых макрофагами, включая кровь. Внеклеточный аденозин активирует аденозиновые рецепторы. Возбуждение рецепторов А2ААR оказывает противовоспалительное действие, защищает поврежденные клетки. Экспериментально, было доказано, что активация А2ААR в клетках микроглии сетчатки было наиболее эффективной в подавлении ингибирования фактора некроза опухоли (TNF), и что лечение агонистом А2ААR приводило к снижению вызванной диабетом гибели клеток сетчатки и высвобождению TNF-a. Последние данные, демонстрирующие, что агонист А2ААR защищает от вызванного диабетом воспаления сетчатки, свидетельствует о том, что нарушение метаболизма аденозина может способствовать осложнениям сетчатки при диабете. Определяя причинно – следственную связь между высвобождением TNF- а, экспрессией и активностью аденозин – дезаминаза – 2 у свиней с диабетической ретинопатией, экспериментальные результаты позволяют предположить, что нарушение метаболизма аденозина при диабете, связано с повышенной  экспрессией и активностью аденозин – дезаминаза – 2. [2, стр.179-184].

1.Материалы и методы

1.1. Посмертные образцы глаза.

Человеческие глаза – 9 недиабетических больных и 8 больных диабетом.

Критерии отбора следующие:

• старше 50 лет
• инсулин - зависимый диабет или без диабета
• глаза энуклеированы в среднем через 6,71 ч после смерти.

1.2. Индукция диабета.

Взято 12 самок йоркширских свиней весом 30 кг. Концентрации глюкозы в сыворотке были измерены ежедневно перед инъекцией, через день в течение следующих двух недель, и каждую вторую неделю на протяжении 12 недель. Свиньи были обработаны подкожной инъекцией инсулина короткого действия (Нормулин) для удержания крови концентрации глюкозы от 350 до 550 мг.[6, стр.4].

1.3. Вестерн - блот  анализ.  Отдельные сетчатки свиней гомогенизировали в буфере RIPA [6, стр. 5]. Проводилась количественная ПЦР в реальном времени, а так же РНК-интерференция. Клетки микроглии трансфицировали свиной или контрольной малой интерферирующей (si) РНК (Ambion) с использованием HiPerFect (Qiagen). Анализировали активность аденозин – дезаминаза – 2. Активность аденозин – дезаминазы – 1 ингибируется аденозин – дезаминазы – 1 -специфическим ингибитором. [5, стр.274].

1.4. Влияние лекарственной терапии или лечения гипоксии на культивируемые клетки микроглии.

Клетки микроглии высевали с плотностью 5x10ˆ5 клеток / лунке в предварительно обработанный коллагеном-1 12-луночный планшет для тканевых культур. Активация микроглии достигалась добавлением амадори-гликированного альбумина, с необнаружимым эндотоксином липополисахарида.[6,стр.5-6].

2.Результаты

2.1. Повышенная экспрессия и активность аденозин – дезаминазы – 2 идентифицирована в сетчатке человека и свиньи с диабетом и в клетках микроглии, обработанных AGA или гипергликемией.

Повышение экспрессии и активности аденозин – дезаминазы – 2  было обнаружено в сыворотке от пациентов с диабетом, что указывает на роль в воспаление аденозин – дезаминазы – 2. С помощью вестерн-анализа повышенная экспрессия аденозин – дезаминазы – 2 была идентифицирована в сетчатке глаз донора человека с диабетом. Более того, повышенная экспрессия аденозин – дезаминазы – 2 была выявлена в сетчатке свиней с 12 неделями диабета. В тех же самых сетчатках экспрессия аденозин – дезаминазы – 1 и CD73 оказалась неизменной. Повышение активности аденозин – дезаминазы – 2 > в 2 раза было выявлено в стекловидном теле у свиней с диабетом. Было выявлено с помощью анализа что, хотя уровни экспрессии дифференцировочного кластера 73 (CD73) оставались неизменными, повышенная экспрессия TNF-a,  A2AAR и аденозин – дезаминазы – 2, но сниженная аденозинкиназа, была выявлена ​​в сетчатке свиньи с диабетом. Кроме того, было проанализировано влияние гипоксии, гипергликемии и экспрессии AGA на аденозин – дезаминазы – 2 и активности в клетках микроглии человека. [6,стр.5]. Эти результаты предполагают, что изменение экспрессии аденозинкиназы  во время воспаления может служить эндогенным защитным механизмом для повышения уровня внеклеточного аденозина и того, что активация всех других механизмов  может быть связана с воспалением в диабетической сетчатке. [1, стр.520-526].

2.2. Аденозин – дезаминазы – 2 экспрессируется в активированной микроглии человека и сетчатки свиньи при диабете. Во время воспаления диспропорциональное увеличение аденозин – дезаминазы – 2  было обнаружено в тканях, богатых макрофагами. Это говорит о том, что аденозин – дезаминазы – 2 участвует в воспалении в макрофагах. Была сделана иммунологическая метка аденозин – дезаминазы – 2  (зеленый) и Iba-1 (красный), маркера активированной микроглии или макрофагов, в сетчатке человека и свиньи при нормальных и диабетических условиях. Совместная локализация аденозин – дезаминазы – 2 и Iba1, идентифицируется только в сетчатке с диабетом. Эти результаты предполагают, что активация в аденозин – дезаминазы – 2  сетчатке диабетической свиньи происходит в активированной микроглии или макрофагах. [3, стр. 232-245].

2.3. Противовоспалительная A2AAR-сигнализация идентифицируется в AGA-активированных клетках сетчатки свиной сетчатки. Передача аденозина через A2AAR в микроглии играет основную роль в противовоспалительном воздействии на сетчатку грызунов во время диабета. Чтобы проверить, играет ли A2AAR роль в противовоспалительной функции свиной сетчатки микроглии при диабете, определяли высвобождение TNF. Было показано, что лечение микроглии AGA, фактором риска развития диабета, симулирует воспаление. Обработка микроглиальных клеток сетчатки свиньи AGA вызывала заметное увеличение высвобождения TNF-a.  Эти результаты идентифицируют передачу сигналов свиньи через A2AAR в качестве критической контрольной точки для TNF-аренды в обработанных AGA клетках сетчатки микроглии. [4, стр.45-54].

2.4. АGA –индуцированное высвобождением GA – индуцированное высвобождением TNF – а в микроглии сетчатки опосредуется ADA2. Чтобы определить причинную роль аденозин – дезаминазы – 2 в опосредовании высвобождения TNF-a, были использованы два подхода. Во-первых, ADA2-нейтрализующее антитело значительно ингибировало AGA-индуцированное высвобождение TNF-a почти дозозависимым образом. Во-вторых, микроглиальные клетки сетчатки свиньи,  временно трансфицировали м-РНК аденозин – дезаминазы – 2 и обрабатывали AGA, как и ранее. Лечение микроглии AGA усиливало высвобождение TNF-a, и этот эффект был значительно снижен в клетках, трансфицированных м-РНК  аденозин – дезаминазы – 2. Этот результат был подтвержден снижением активности аденозин – дезаминазы – 2 в клетках, трансфицированных м-РНК, но не скремблированной м-РНК. Этот результат предполагает, что аденозин – дезаминазы – 2 опосредует AGA-индуцированное высвобождение TNF в микроглии сетчатки. [6, стр. 6].

Выводы

Во время воспаления повышается активность аденозин – дезаминазы – 2 в тканях богатых макрофагами. Аденозин – дезаминазы – 2 является маркером для больных со следующими патологиями:  сахарный диабет, туберкулез, ВИЧ – инфицированные. Аденозин – дезаминазы – 2 выражает свою активность только в условиях гипоксии или воспаления. Исследования подтвердили, что А2ААR повышены, СD73 не изменяется, аденозинкиназа понижается во время воспаления. Понижение экспрессии аденозинкиназы, служит в качестве эндогенного механизма защиты, повышающего уровень внутриклеточного аденозина. Повышенная активность аденозин – дезаминазы – 2 может усиливать воспаление сетчатки, метаболизируя внеклеточный аденозин и повышенная активность, связанна с развитием воспаления при диабете. Аденозин – дезаминазы – 2 выступает как фактор роста, который способствует активации микроглии и пролиферации макрофагов. Таким образом, накопление  гликозилированного  альбумина  Амандори  (АGA) в сетчатке вызывает активацию микроглии и аденозин – дезаминазы – 2.[6,стр. 7].